黃金莎 徐 莉 閆云君**

（1）華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430074；2）華中科技大學(xué)分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074）

酶作為一種綠色可持續(xù)的生物催化劑［1］，在工業(yè)中應(yīng)用廣泛，如用于紡織、洗衣、造紙和食品行業(yè)的淀粉酶［2］，用于造紙和紙漿行業(yè)的木聚糖酶［3-4］，用于食品、制藥、紡織和化妝品行業(yè)的脂肪酶［5-6］，以及用于制藥、食品和紡織行業(yè)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶［7］等。自然進(jìn)化的酶通常不適合在惡劣環(huán)境中使用或催化自然界中不存在的新型反應(yīng)，很少是工業(yè)用途的最佳選擇［8-10］。為此，蛋白質(zhì)工程策略被用來改善酶的穩(wěn)定性和催化多樣性，以滿足不斷增長的生物技術(shù)應(yīng)用需求［11-14］。隨著對結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的深入了解，結(jié)構(gòu)修飾已成為增強(qiáng)或改變其穩(wěn)定性/催化活性的有利工具［15-18］。本綜述集中討論了近年來基于結(jié)構(gòu)修飾的蛋白質(zhì)工程策略在改善酶穩(wěn)定性或/和催化活性方面的成功應(yīng)用（圖1）。

Fig.1 Structural modification to optimize enzyme thermostability or/and catalytic activity圖1 改善酶熱穩(wěn)定性或/和催化活性的結(jié)構(gòu)修飾策略

1 穩(wěn)定性改造

高溫有助于加速反應(yīng)和底物的溶解度，并減少微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，熱穩(wěn)定性是衡量酶工業(yè)應(yīng)用可行性的一個(gè)關(guān)鍵因素，是酶分子在高溫下保持結(jié)構(gòu)和功能完整性的一種特征。熱穩(wěn)定性的酶通常具有良好的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，能夠在相對苛刻的條件下進(jìn)行預(yù)處理，并在高溫下保持高度的耐熱性和催化能力［19-20］。同時(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與表達(dá)水平有關(guān)［21-22］，追求蛋白質(zhì)穩(wěn)定性也是滿足實(shí)際應(yīng)用需要的合理表達(dá)量的重要原因。報(bào)道指出，對結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性處理后可以使其表達(dá)量提高100 倍以上［23］。此外，穩(wěn)定的蛋白質(zhì)傾向于顯示更好的溶解度［24］。雖然穩(wěn)定性不直接影響蛋白質(zhì)的聚集，但對于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，解折疊導(dǎo)致埋藏的疏水側(cè)鏈暴露，聚集趨勢增加［25］。最后，在蛋白質(zhì)工程中，具有較高熱穩(wěn)定性的酶可以接受更廣泛的有益突變，同時(shí)保留其原始結(jié)構(gòu)，因而表現(xiàn)出更大的進(jìn)化潛力［26］。

1.1 熱穩(wěn)定性常用表示方法

最常用于描述蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的參數(shù)是熔解溫度（melting temperature，Tm）、半衰期（t1/2）、熱半失活溫度（T50）和解折疊吉布斯自由能（ΔG）。Tm表征蛋白質(zhì)二級或三級結(jié)構(gòu)的可逆或不可逆的展開，被認(rèn)為是評估熱穩(wěn)定性最有參考價(jià)值的指標(biāo)之一，其數(shù)值可通過差示掃描熒光（differential scanning fluorimetry，DSF）進(jìn)行測定［27-28］。t1/2是在給定溫度下保持一半活性所需的時(shí)間，代表了酶的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性［29］。T50是50%的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變的溫度，可通過分析熱處理后蛋白質(zhì)的活性來確認(rèn)［30］。值得注意的是，由于酶分子在解折疊的同時(shí)伴隨酶活力的損失，Tm和T50雖不完全相同，但通常顯示非常接近的相關(guān)性［31］。蛋白質(zhì)解折疊吉布斯自由能（ΔG）定義了野生型和突變體之間的平衡，即更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)包含更少部分的變性分子［32］。

1.2 熱穩(wěn)定性主要影響因素

由于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性取決于其分子結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)是一種改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性可行且有效的方法［33-35］。影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的主要因素包括非共價(jià)作用（疏水性、氫鍵數(shù)目、鹽橋、芳香環(huán)相互作用）、共價(jià)相互作用（二硫鍵）、脯氨酸和甘氨酸數(shù)目及柔性區(qū)域的分布等［36-37］。

1.2.1 疏水相互作用

疏水相互作用的增加可以降低蛋白質(zhì)在高溫下解折疊的速率，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵作用［38］。最近的研究表明，因?yàn)榇蠖鄶?shù)天然酶具有一個(gè)良好的疏水核心，因此通過單一的突變，特別是通過隨機(jī)突變提高熱穩(wěn)定性越來越困難［37］。計(jì)算機(jī)輔助策略引入非極性氨基酸或者去除不穩(wěn)定因素（埋藏的帶電殘基、不合理的氫鍵等）已成為一種極具潛力的改良熱穩(wěn)定性方法［39］。為了提高土曲霉（Aspergillus terreus）轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性，研究人員［40］通過B 因子和解折疊自由能的計(jì)算，使用非極性氨基酸取代極性氨基酸或帶電氨基酸，獲得了4 個(gè)穩(wěn)定的突變體（T130M、T130F、E133F和D134L），其值增加了0.7~5.0℃。結(jié)構(gòu)分析表明，135位點(diǎn)的異亮氨酸（I）與130位點(diǎn)的甲硫氨酸（M）或苯丙氨酸（F）、132 位點(diǎn)的脯氨酸（P）與133位點(diǎn)的苯丙氨酸（F）分別形成了新的疏水相互作用（圖2a），是其熱穩(wěn)定性改善的重要原因?；赗osettaDesign框架的RosettaVIP協(xié)議可以搜索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部折疊不合理的疏水空隙，準(zhǔn)確地識(shí)別穩(wěn)定性殘基，使蛋白質(zhì)疏水核心折疊更加穩(wěn)定。Borgo 和Havranek［41］基于此方法自動(dòng)設(shè)計(jì)甲硫氨酸氨肽酶，通過選擇引入疏水相互作用的點(diǎn)突變提高其核心折疊的質(zhì)量。突變體eMAP5-fold中引入的5個(gè)突變（V24I、C45L、V207I、A152I 和F156L）減小了掩埋在內(nèi)部的空隙體積，使其Tm值增加17.6℃。

1.2.2 氫鍵

氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重要因素，對維持其構(gòu)象穩(wěn)定性也至關(guān)重要［19，42］。研究表明，嗜熱酶的晶體結(jié)構(gòu)中存在較多數(shù)量的氫鍵，且氫鍵是最多被引用解釋熱穩(wěn)定性提高的物理性質(zhì)［37］。氫鍵引入是定向進(jìn)化的一種常見方式。Akbulut等［43］利用DNA shuffling 和定點(diǎn)突變方法構(gòu)建了短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）脂肪酶突變體L3-3，在50℃的半衰期提高了約9 倍。該突變體含有3 個(gè)重要突變（G14S、A15G 和V109S），其中G14S 和A15G 位于連接折疊β1 和螺旋αa 的loop（10~15）中，額外創(chuàng)建了兩個(gè)氫鍵S14-G11和S14-N18加強(qiáng)loop 區(qū)域的剛性。另外，109 位點(diǎn)的絲氨酸（S）側(cè)鏈分別與N48的Nδ2原子（螺旋αB的N端殘基）和A81 的主鏈氧（螺旋αC 中）直接形成氫鍵，將loop（109~123）固定在核心的二級結(jié)構(gòu)，也增加了螺旋αB的N端剛性（圖2b）。蛋白質(zhì)內(nèi)的高柔性區(qū)域在熱變性中很可能是最先開始解折疊，預(yù)測和剛化蛋白質(zhì)柔性部位的剛化柔性位點(diǎn)的策略（rigidifying flexible sites，RSF）也是提高酶熱穩(wěn)定性的一種有效方法［44］。上海交通大學(xué)的馮雁教授團(tuán)隊(duì)［30］通過識(shí)別并突變南極假絲酵母（Candidaantarctica）脂肪酶B 催化絲氨酸（S105）10范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)靈活的殘基，得到了突變體D223G/L278M。該突變在α10螺旋內(nèi)形成了額外的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增加了片段的剛性，使48℃下的半衰期增加了13倍，值增加了12℃。

1.2.3 鹽橋

鹽橋通常位于蛋白質(zhì)的表面，在高溫下對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性發(fā)揮積極作用，鹽橋數(shù)目越多蛋白質(zhì)越穩(wěn)定［42，45-46］。因此，基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表面鹽橋設(shè)計(jì)是提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性又一個(gè)重要手段。研究表明，靈活性可以作為鹽橋設(shè)計(jì)的重要指標(biāo)，在柔性區(qū)域添加鹽橋有助于增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)剛性。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬確定了嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）脂肪酶的一個(gè)高度靈活的區(qū)域（序列160~200），通過設(shè)計(jì)突變G165D 和F73R 引入新的鹽橋，從而增加脂肪酶的熱穩(wěn)定性。與野生型脂肪酶相比，突變體在50℃時(shí)的半衰期提高了900倍以上，最適溫度從35℃提高到90℃［47］。引入鹽橋的另一個(gè)方法是將熱不穩(wěn)定區(qū)域的不帶電殘基突變?yōu)閹щ姎埢?。江南大學(xué)的李兆豐教授團(tuán)隊(duì)［48］基于理性設(shè)計(jì)策略，在熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（Geobacillus thermoglucosidans）STB02 1,4-α-葡聚糖分支酶中分別引入5 個(gè)鹽橋，獲得的突變體（Q231R-D227、 Q231K-D227、T339E-K335、 T339D-K335 和 I571D-R569） 在60℃下的半衰期比野生酶增加了17%~51%，證明了非天然鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性的重要貢獻(xiàn)。2023年，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合B因子和可及表面積計(jì)算，在兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)（73 和137 位）構(gòu)建了新的鹽橋（圖2c）。結(jié)果顯示，在137 位點(diǎn)處引入的谷氨酸（E）與R140 形成了額外的靜電相互作作用，加強(qiáng)了GBE的loop結(jié)構(gòu)，其半衰期提高了36.6%［49］。

1.2.4 芳香環(huán)相互作用

芳香環(huán)相互作用（π stacking，π-π stacking）是一種距離小于7的兩個(gè)芳香環(huán)之間的非共價(jià)作用，同時(shí)具備氫鍵和疏水作用的特點(diǎn)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要機(jī)制［50］。通過多序列比對和結(jié)構(gòu)分析，使用疏水色氨酸（W）取代位于皺褶念珠菌（C. rugosa）脂肪酶的非保守酰基結(jié)合殘基G414，不僅與鄰近殘基形成了新的疏水網(wǎng)絡(luò)，還與F125和F415產(chǎn)生了新的芳香相互作用（圖2d），獲得的突變體G414W 在60℃時(shí)的半衰期提高了6.5 倍，提高了14℃，最適溫度增加了15℃［51］。通過在嗜熱脂肪地芽孢桿菌（G. stearothermophilus）T6脂肪酶溶劑通道中加入芳香族殘基（苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸），Gihaz等［52］揭示了新芳香環(huán)相互作用（π-π或CH-π）對增強(qiáng)酶在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性的重要性。研究表明，通過該方法獲得的單點(diǎn)突變體L360F 穩(wěn)定性比野生型提高了81 倍，且苯丙氨酸（F）在雙重突變體A187F/L360F 中的組合使其在甲醇中的Tm值增加了7℃。

1.2.5 二硫鍵

二硫鍵是通過一對半胱氨酸被氧化后形成的，可以降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)下的構(gòu)象熵，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用（圖2e）［53-54］。研究表明，通過在甲硫氨酸脫氨酶遠(yuǎn)離活性部位引入二硫鍵突變獲得的突變體M3在50℃的半衰期增加了2.3倍［55］。引入二硫鍵的關(guān)鍵問題是突變位置的選擇，在不合適的位置引入額外的二硫鍵有可能損害其內(nèi)在的活性和穩(wěn)定性［56］。江南大學(xué)的李兆豐教授團(tuán)隊(duì)基于結(jié)構(gòu)信息和計(jì)算機(jī)工具（MODIP、Disulfide by Design2、FoldX 和AlphaFold2）設(shè)計(jì)了兩個(gè)嗜糖假單胞菌（Pseudomonas saccharophila）STB07 淀粉酶突變體（A211C-S214C 和S409CQ412C），與野生型相比，突變體A211C-S214C 在60℃時(shí)的半衰期增加2.6 倍，突變體S409C-Q412C的熱穩(wěn)定性沒有顯著變化。通過結(jié)合結(jié)構(gòu)差異分析和MD模擬發(fā)現(xiàn)，loop8（140~167）的剛性對蛋白質(zhì)局部和全局穩(wěn)定十分重要，而二硫鍵S409CQ412C 距離loop8 較遠(yuǎn)，只能選擇性地穩(wěn)定突變體結(jié)構(gòu)的CBM20區(qū)域（尤其是loop30），因此盡管引入了相同數(shù)量的二硫鍵，突變體A211C-S214C 顯示出比S409C-Q412C 更好的熱穩(wěn)定性。目前，二硫鍵工程具有一套比較成熟的設(shè)計(jì)流程［54］：首先，使用二硫鍵預(yù)測工具設(shè)計(jì)潛在的二硫鍵；然后，根據(jù)突變位置、幾何結(jié)構(gòu)及突變引起的自由能變化，剔除不合理的二硫鍵；最后，通過Ellman 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二硫鍵的形成，并分析突變體穩(wěn)定性。

1.2.6 引入脯氨酸或取代甘氨酸

Fig. 2 Introduction of non-covalent/covalent interactions by structural modification to improve thermal stability圖2 結(jié)構(gòu)修飾引入非共價(jià)/共價(jià)相互作用提高酶熱穩(wěn)定性

天然氨基酸中，脯氨酸具有最低的構(gòu)象熵，甘氨酸具有最高的構(gòu)象熵。同二硫鍵一樣，脯氨酸和甘氨酸都是基于“熵穩(wěn)定”的策略增強(qiáng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性［44］。因此，在靈活性區(qū)域引入脯氨酸等剛性氨基酸或取代甘氨酸等柔性氨基酸，也是提高酶穩(wěn)定性的有效途徑［37］。為了提高柄藍(lán)狀菌（Talaromyces stipitatus）1,4-b-D-半乳糖內(nèi)切酶的半衰期，基于B-FITTER 和PoPMuSiC 在K31 和T172位點(diǎn)分別引入脯氨酸突變，其55℃的半衰期分別增加了55%和56%；同時(shí)，在半理性設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上獲得了突變體G305A，其在55℃的半衰期為（114.4±8.1） min，與野生型相比大約提高了9倍［57］。為了提高來源于Bacillus pumilus的木聚糖酶的穩(wěn)定性，Bhat 等［58］選擇該酶N 端區(qū)域的前6個(gè)殘基RTITNN進(jìn)行突變，并通過分子動(dòng)力學(xué)模擬評估突變體的穩(wěn)定性。研究表明，通過采用脯氨酸（P）和纈氨酸（V）取代第5 位和第6 位的天冬氨酸（D），引入剛性構(gòu)象的氨基酸，增強(qiáng)了C端與N端的遠(yuǎn)程相互作用，實(shí)現(xiàn)了酶穩(wěn)定性的提高。

1.2.7 截短柔性區(qū)域

蛋白質(zhì)中的柔性環(huán)（loop）和無序端部結(jié)構(gòu)（N 和C 端）也是導(dǎo)致不穩(wěn)定性的因素之一，可通過截短方式進(jìn)行調(diào)控［37］。研究人員通過刪除1,4-α-葡聚糖分支酶C 端的最后26 個(gè)殘基，提高蛋白質(zhì)的整體剛性，獲得的截短突變體不僅具有更高的熱穩(wěn)定性和可溶性，且其酶活性未受到顯著損害［29］。突變或刪除遠(yuǎn)端無序可變的loop區(qū)中氨基酸殘基也可以改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的吳永堯教授團(tuán)隊(duì)［59］發(fā)現(xiàn)，與天然甘露聚糖酶Man1312 相比，N 端殘基（V3、N7 和Q11）的缺失顯著增加了酶的熱穩(wěn)定性，其中三位點(diǎn)突變體MandVNP 的最適溫度提高了10℃，Tm值提高了8℃。

增加非共價(jià)鍵（疏水相互作用、氫鍵、鹽橋和芳香環(huán)相互作用）和“熵穩(wěn)定”策略（引入二硫鍵、增加脯氨酸、減少甘氨酸和柔性區(qū)域截短）已被證明在獲得熱穩(wěn)定突變體方面非常有效。蛋白質(zhì)工程作為改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的有力工具備受關(guān)注，表1總結(jié)了一些基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息輔助酶穩(wěn)定性改造的常用工具或方法。

Table 1 Summary of several popular tools or methods for enzyme stability表1 輔助酶穩(wěn)定性改造的常用工具或方法

2 催化活性改造

除了熱穩(wěn)定性外，酶的催化特性（包括催化活性、底物特異性和對映選擇性）也是影響最終產(chǎn)品生成速率的一個(gè)重要因素［74-75］。然而，天然酶的底物特異性強(qiáng)且底物譜窄，通常只能催化單一底物或具有類似結(jié)構(gòu)的底物［76］。結(jié)構(gòu)指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)工程可以通過改變酶的底物結(jié)合口袋或結(jié)合通道中氨基酸的類型，降低空間位阻、拓寬催化口袋、增加底物親和力和調(diào)節(jié)活性位點(diǎn)的靈活性，優(yōu)化底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放，從而改善酶的功能［77-80］。

2.1 拓寬底物結(jié)合口袋，降低空間位阻

酶促反應(yīng)中，空間位阻效應(yīng)對酶活性和立體選擇性有很大影響［77］。通過使用較小側(cè)鏈氨基酸如甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、半胱氨酸（C）、絲氨酸（S）、脯氨酸（P）和纈氨酸（V）等，能夠減輕底物結(jié)合口袋和底物間不利的空間位阻，增加其催化活性［36］。清華大學(xué)于慧敏教授團(tuán)隊(duì)［81］首先通過分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，確定與底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基；然后通過由苯丙氨酸（F）、天冬氨酸（D）、纈氨酸（V）和丙氨酸（A）組成的簡化氨基酸字母表生成了一個(gè)小而精的突變體庫來微調(diào)底物結(jié)合口袋。通過引入突變，將125位點(diǎn)大側(cè)鏈的酪氨酸（Y）替換為小側(cè)鏈的丙氨酸（A），不僅擴(kuò)大了底物結(jié)合口袋的體積，還與底物形成額外的疏水相互作用，顯著增強(qiáng)了突變體RbTAM1（Y125A）的活性?；诮Y(jié)構(gòu)信息和生物信息學(xué)，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的江正強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)［82］對酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）糖苷水解酶的底物結(jié)合裂隙中的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變以提高其水解活性，通過引入K238A 和W239Y突變減少了K238 和W239 形成的空間位阻，其酶活性分別提高了112.9%和36.4%。同時(shí)，上海健康醫(yī)學(xué)院的邵雷研究員［83］合理選擇了高加索乳桿菌（Lactobacillus kefiri）醇脫氫酶（LkADH）催化口袋及其周圍5個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行迭代突變，最終獲得的突變體seq5 （Y190P/I144V/L199V/E145C/M206F）表現(xiàn)出最高酶活性和優(yōu)秀的立體選擇性（對映體過量（ee）>99%）。分子模擬結(jié)果表明，通過改變結(jié)合口袋的大小和構(gòu)建更多的非共價(jià)作用，增強(qiáng)了突變體對底物二芳基酮的活性。因此，使用側(cè)鏈較小的氨基酸替換側(cè)鏈較大的氨基酸，不僅能夠最小化催化口袋空間位阻效應(yīng)，還能與底物形成額外的非共價(jià)相互作用，從而提高酶活性。

2.2 增加底物親和力

研究表明，使用較大側(cè)鏈?zhǔn)杷畾埢〈^小側(cè)鏈?zhǔn)杷畾埢?，能夠縮短底物與結(jié)合口袋中相關(guān)殘基間的距離，提高酶的催化效率［84］。研究人員［85］通過分子對接分析大阪伊德氏桿菌（Ideonella sakaiensis）聚酯水解酶和底物（對苯二甲酸乙二醇酯，PET）之間的相互作用，確定底物結(jié)合口袋周圍6個(gè)關(guān)鍵殘基。其中，I179與底物直接作用影響底物定位，因此當(dāng)I179 被突變?yōu)榫哂休^大側(cè)鏈且更疏水的苯丙氨酸（F）時(shí)，能夠定位底物PET的苯環(huán)方向，縮短其與關(guān)鍵殘基的作用距離，顯著提高催化效率。與野生型PETase 相比，突變體I179F 的Km減少了3.8 倍，kcat/Km值增加了15.6 倍，對PET 的降解效率提高了2.1 倍。酶與底物之間的結(jié)合自由能與酶的催化效率是負(fù)相關(guān)的，可通過虛擬突變預(yù)測酶-底物結(jié)合自由能的變化篩選目標(biāo)位點(diǎn)，獲得理想催化劑［86-87］。為了提高茂源鏈霉菌（S. mobaraenesis）谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶TGm1的催化活性，研究人員［86］使用Discovery Studio柔性對接構(gòu)建42 個(gè)FRAPD-TGm1/CBZ-Gln-Gly 對接結(jié)構(gòu)，并在活性位點(diǎn)Cys64 的15 ? 范圍內(nèi)進(jìn)行虛擬飽和誘變。基于酶-底物復(fù)合物集合自由能變，產(chǎn)生了15個(gè)結(jié)合自由能低于-0.8 kcal/mol的突變體。其中突變E28T對活性有正向影響，使FRAPD-TGm1的比活力增加了23.7%。

2.3 調(diào)節(jié)活性位點(diǎn)靈活性

活性位點(diǎn)的構(gòu)象靈活性是影響酶催化活性的另一個(gè)重要因素，調(diào)節(jié)活性區(qū)域的靈活性也是酶進(jìn)化的一種有效策略［88］。以菊粉外切酶InuAGN25 為例，通過取代催化口袋中的剛性脯氨酸（P236），增加突變體P236E催化結(jié)構(gòu)域的靈活性，進(jìn)而提高其催化活性［89］。天冬氨酸酶是一種高特異性的氨裂解酶，Cui 等［78］通過在天冬氨酸酶底物結(jié)合區(qū)或接近活性口袋的區(qū)域引入適當(dāng)突變，設(shè)計(jì)了高效的多功能C-N 裂解酶。 在靠近鏈霉菌（Streptomycessp.）82F2 酰胺水解酶（DAH）催化中心S86 附近，存在一個(gè)對氨解至關(guān)重要的小口袋，其中I338是底物識(shí)別的重要?dú)埢lyas等［90］發(fā)現(xiàn)使用較小的丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或絲氨酸（S）取代338位點(diǎn)的異亮氨酸（I）可同時(shí)改變DAH 結(jié)合口袋空間和形狀、局部靈活性以及靜電環(huán)境，增加催化中心S86 對?；荏w（Ac-d-Phe-OMe）的親和力，顯著提高突變體的催化效率。此外，Alcalde等［91］發(fā)現(xiàn)底物進(jìn)入通道對酶催化效率也至關(guān)重要。在這項(xiàng)工作中，作者使用體積較小的丙氨酸（A）和亮氨酸（L）取代非特異性過加氧酶血紅素通道表面兩個(gè)較大的苯丙氨酸（F76和F191），通過增加參與血紅素通道形成的α 螺旋的靈活性改變其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，使得底物通道的訪問受到限制，從而降低突變體AaeUPO催化效率。

基于結(jié)構(gòu)信息，聚焦活性位點(diǎn)殘基，結(jié)合通道殘基和結(jié)合口袋中柔性位點(diǎn)，改變催化口袋的結(jié)合形狀及與底物分子的親和力，能夠更加高效合理地創(chuàng)制具有所需催化功能的催化劑［35］。近年來，人們開發(fā)了一些輔助催化功能改造的工具或策略，用于快速篩選合適的突變位點(diǎn)（表2）。

Table 2 Summary of applicable tools or strategies for enzyme function prediction表2 輔助酶催化功能改造的常用工具或策略

3 組合策略輔助酶的熱穩(wěn)定性和活性共進(jìn)化

值得注意的是，新功能的產(chǎn)生或現(xiàn)有功能的改進(jìn)，導(dǎo)致進(jìn)化偏離原始序列，進(jìn)而可能會(huì)影響催化劑的其他特性［36，99］。許多研究表明，熱穩(wěn)定性的提高往往伴隨著結(jié)構(gòu)僵化，導(dǎo)致酶活性降低［86，100-101］，而在底物結(jié)合區(qū)或接近活性口袋區(qū)域的靈活性突變將可增加整體構(gòu)象的靈活性，從而改變酶的熱穩(wěn)定性［32，36，101］。鑒于穩(wěn)定性和催化活性間可能的負(fù)相關(guān)性，可采用以下幾種策略以同時(shí)克服操縱蛋白質(zhì)功能和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所帶來的挑戰(zhàn)。

3.1 基于理性計(jì)算優(yōu)選突變熱點(diǎn)

自然進(jìn)化中，保守性區(qū)域?qū)Πl(fā)揮酶分子正常的生物學(xué)功能至關(guān)重要，不同位置氨基酸的進(jìn)化保守性和突變耐受性是相關(guān)的［102］。因此，為了提高突變文庫的質(zhì)量，科研人員通常避免選擇進(jìn)化上高度保守的位置進(jìn)行突變［54，103-104］。華中科技大學(xué)的閆云君教授團(tuán)隊(duì)［105］通過深度序列分析，確定了米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶中氨基酸在同源序列中的保守性等級，并將影響催化性質(zhì)的關(guān)鍵位點(diǎn)從通過理性設(shè)計(jì)算法預(yù)測的突變中排除，構(gòu)建了“小而精”突變體文庫。研究表明，表面殘基對突變的耐受性要比埋在核心中的殘基高得多，因此將“熱點(diǎn)”集中在暴露于溶劑的殘基能盡量減少突變引起的不穩(wěn)定性和對酶功能的影響［106］。為了改善疣孢青霉（Penicillium verruculosum）內(nèi)切葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，Bashirova 等［107］在酶結(jié)構(gòu)表面引入二硫鍵，構(gòu)建兩個(gè)突變體S127C-A165C（DSB2）和Y171C-L201C（DSB3）。與野生酶相比，突變體在70℃和80℃下的半衰期增加了1.5~2倍，且對羧甲基纖維素和β葡聚糖的比活力增加了15%~21%。提高突變體文庫質(zhì)量的另一個(gè)強(qiáng)大方法是分析位點(diǎn)靈活性或解折疊自由能變。FRESCO是基于能量分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬提高酶穩(wěn)定性的有效策略（圖3）［72］。該策略首先使用多種算法（Rosetta ddg、FoldX 和Disulfide Discovery）生成穩(wěn)定突變，然后結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬剔除增加靈活性的不合理突變，在保持檸檬烯環(huán)氧化物水解酶完整催化功能的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了酶穩(wěn)定性的更大飛躍（Tm+35°C）。解折疊自由能是反映蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要參數(shù)，隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可通過相關(guān)軟件或程序預(yù)測突變對目標(biāo)蛋白質(zhì)解折疊自由能的影響（ΔΔGfolding=ΔGfolding（突變體）-ΔGfolding（野生型）），精簡突變位點(diǎn)，避免突變引起的不穩(wěn)定性。研究人員［40］首先基于B 因子策略選擇Aspergillus terreus轉(zhuǎn)氨酶中柔性殘基構(gòu)建飽和突變體文庫，然后使用FoldX 計(jì)算突變體和野生型的折疊自由能值的變化，最終選擇了更剛性的氨基酸取代突變位點(diǎn)。獲得的雙重突變體T130M/E133F 在40℃的t1/2提高了3.3倍，提高了5.0℃。同樣的，華中科技大學(xué)的閆云君教授團(tuán)隊(duì)［108］組合使用Rosetta、I-Mutant和FoldX三種理性設(shè)計(jì)方法計(jì)算突變對自由能的影響，構(gòu)建了一個(gè)C. rugosa脂肪酶的有限突變體文庫。在該文庫中，突變體D457F 的熱穩(wěn)定性最高，其在50℃時(shí)的t1/2比野生酶延長了5.5倍，最適溫度提高了10℃。

Fig. 3 Scheme illustration of FRESCO：generating stable mutations with multiple algorithms［72］圖3 FRESCO流程圖：組合使用多種算法生成穩(wěn)定的突變［72］

3.2 基于多重蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或活性改造策略的共進(jìn)化

除了優(yōu)選突變熱點(diǎn)，還可以采用共進(jìn)化策略同時(shí)提高穩(wěn)定性和活性［32］。云南師范大學(xué)的周峻沛等［89］發(fā)現(xiàn)，同時(shí)提高外源性胰島素酶末端的剛性和催化結(jié)構(gòu)域的靈活性，可以改善該胰島素酶的低溫活性和熱穩(wěn)定性。與野生酶相比，基于改造獲得的8 重突變體RfsMut8S 在50℃下的熱穩(wěn)定性大大提高，同時(shí)低溫活性明顯改善。鑒于在活性部位插入大量的突變可能會(huì)損害酶的穩(wěn)定性，華中科技大學(xué)的閆云君教授團(tuán)隊(duì)［54］基于不同結(jié)構(gòu)域組合使用多重改造策略，以實(shí)現(xiàn)催化活性和穩(wěn)定性的共進(jìn)化。首先，使用Rosetta Cartesian_ddg 策略計(jì)算底物結(jié)合口袋中氨基酸突變對酶-底物復(fù)合物間結(jié)合能的影響，預(yù)測增加酶與底物親和力的單點(diǎn)突變。選擇活性最高的Cartesian_ddg設(shè)計(jì)，再利用組合算法（disulfide by design、MODIP 和BridgeD）計(jì)算出潛在的可形成二硫鍵的氨基酸突變對，最終獲得的突變體E265V/S267W/S61C-S115C/E190C-E238C對不同碳鏈長度對硝基苯酚酯的催化活性提高1.5~3.8 倍，且Tm值 提 高8.5℃。DuraPETase 是 基 于GRAPE策略獲得的高度穩(wěn)定的突變體［109］，江南大學(xué)的吳敬教授團(tuán)隊(duì)［110］通過整體剛性改進(jìn)（N233C/S282C）、關(guān)鍵區(qū)域靈活性調(diào)整（H214S）和蛋白質(zhì)表面靜電荷優(yōu)化（S245R）協(xié)同提高DuraPET的熱穩(wěn)定性和生物降解能力（圖4）。構(gòu)建的突變體DuraPETase-4M 在96 h 后可降解93.3%的無定形PET粉末和69.8%的PET預(yù)制膜，對這兩種底物的降解速率分別達(dá)到DuraPETase 的3.2 和5.4 倍。另外，在酶的折疊過程中，殘基側(cè)鏈原子之間的疏水相互作用會(huì)產(chǎn)生空腔，江南大學(xué)的夏小樂教授團(tuán)隊(duì)［111］提出了一種基于計(jì)算技術(shù)（high hydrostatic pressure molecular dynamics，B-Fitter）的由內(nèi)而外的空腔工程（cavity engineering）策略，探索了Rhizomucer miehei脂肪酶空腔體積及空間分布的變化對熱穩(wěn)定性和催化活性的影響。結(jié)果表明，內(nèi)腔體積的減少和空間重排不僅有助于提高酶的穩(wěn)定性，還通過優(yōu)化底物通道改善了其催化效率。其中，三重突變體T21V/S27A/T198L 的Tm值升高了11.0℃，在65℃時(shí)半衰期增長了28.7倍，比活力增加了9.9倍（高達(dá)5 828 U/mg），是目前報(bào)道的具有較高酶活性的脂肪酶之一。以上研究很好地證明了通過積累一系列對蛋白質(zhì)活性、穩(wěn)定性有積極作用的突變實(shí)現(xiàn)活性和穩(wěn)定性共進(jìn)化的可能性。

Fig. 4 Synergistically improve the thermostability and biodegradability of DuraPETase via enhanced overall rigidity，key region flexibility adjustment and electrostatic charge optimization［110］圖4 通過整體剛性改進(jìn)、關(guān)鍵區(qū)域靈活性調(diào)整和蛋白質(zhì)表面靜電荷優(yōu)化協(xié)同提高DuraPET酶的熱穩(wěn)定性和生物降解能力［110］

另外，當(dāng)某一功能被破壞后，可通過額外的設(shè)計(jì)及時(shí)修復(fù)“受損”的工程突變體。以β葡萄糖苷酶Bgl6為例，中山大學(xué)的劉玉煥教授團(tuán)隊(duì)［99］首先利用計(jì)算機(jī)輔助工程策略和重塑底物結(jié)合口袋生成了穩(wěn)定性增強(qiáng)、活性增加的突變體，但對底物的耐受性相對降低。為了避免在高濃度葡萄糖溶液下酶分子的不穩(wěn)定性，重新設(shè)計(jì)了活性部位空腔的關(guān)鍵區(qū)域，在多重選擇壓力下最終得到了同時(shí)改善熱穩(wěn)定性（半衰期為20倍）、活性（kcat/Km為5.6倍）和葡萄糖耐受性（ΔIC50為200 mmol/L）的突變體M12（圖5）。

Fig. 5 Simultaneous optimization of multiple properties（thermostability， activity and glucose tolerance）of β-glucosidase Bgl6 in combination with computer-aided strategies，pocket engineering and region redesign strategies［99］圖5 利用計(jì)算機(jī)輔助策略、口袋工程及區(qū)域重新設(shè)計(jì)策略同時(shí)優(yōu)化β葡萄糖苷酶Bgl6的熱穩(wěn)定性、活性和葡萄糖耐受性［99］

3.3 基于高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)骨架創(chuàng)造或/和優(yōu)化蛋白質(zhì)功能

蛋白質(zhì)工程的最終目標(biāo)是創(chuàng)造或優(yōu)化蛋白質(zhì)的功能。在賦予新功能的突變中，蛋白質(zhì)的存活能力與其穩(wěn)定性呈正相關(guān)［25-26，32］。因此，可選用高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)作為功能性改造的起始結(jié)構(gòu)，以平衡突變造成的不穩(wěn)定影響［23，25，100］。Arnold 及其同事［26］通過對穩(wěn)定性較差（T50=47℃）和較好（T50=62℃）的P450 BM3突變發(fā)現(xiàn)，高穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對突變具有很強(qiáng)的耐受性，允許接受更廣泛的有益突變，并能折疊到其原始結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出新的或改進(jìn)的功能。PaDa-I是高度穩(wěn)定的真菌非特異性過氧合酶突變體［112］，Alcalde等［113］將其置于FuncLib設(shè)計(jì)中，以快速生成功能性多點(diǎn)突變體。經(jīng)過一次FuncLib設(shè)計(jì)，在其催化核心中發(fā)生2~5個(gè)改變，生成了24個(gè)突變體。與PaDa-I 相比，將底物從烷基轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷懔u基后，其催化效率提高了10倍。

保持蛋白質(zhì)足夠的穩(wěn)定性是從文庫中獲得有利突變體的前提條件［32］。如果特定的生化或/和生物活性要求選擇不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)作為起始骨架，可以在賦予新功能前初步提高親代蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（即先穩(wěn)定蛋白質(zhì)，后進(jìn)行功能改造）［100］。PROSS 設(shè)計(jì)旨在獲得具有更高的穩(wěn)定性和表達(dá)性的突變體，只允許在活性部位之外進(jìn)行設(shè)計(jì)［24］。FuncLib旨在提高催化活性或改變底物范圍，設(shè)計(jì)過程僅限于活性部位的殘基［96］?；诖?，F(xiàn)leishman 等［114］首先應(yīng)用PROSS 對3 個(gè)漆酶的可表達(dá)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了設(shè)計(jì)。然后，選擇了最穩(wěn)定PROSS 設(shè)計(jì)作為FuncLib 活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的起點(diǎn)，在底物氧化位點(diǎn)內(nèi)實(shí)施3~7次突變，獲得了具有廣泛親和力及高度穩(wěn)定性的酶。同樣地，Shah等［115］首先將環(huán)狀芽胞桿菌（B. circulans）木聚糖酶（BCX）插入融合到激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）嗜熱麥芽糊精結(jié)合蛋白（PfMBP）， 得到了復(fù)合物PfMBPBCX165。該復(fù)合物不僅完整保留了BCX一級序列還具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，有助于探索整個(gè)BCX 序列空間進(jìn)行功能進(jìn)化。然后作者［116］將PfMBPBCX165中的BCX序列隨機(jī)突變，通過文庫篩選發(fā)現(xiàn)突變T50R可以在不影響熱穩(wěn)定性前提下，增強(qiáng)PfMBP-BCX165 在堿性pH 中的活性。另外，江南大學(xué)陳堅(jiān)院士團(tuán)隊(duì)的劉松副教授課題組［86］組合使用多種理性設(shè)計(jì)策略提高了S. mobaraenesis谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性及催化活性。首先，基于Rosetta Cartesian_ddg 進(jìn)行了虛擬脯氨酸掃描，獲得熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的突變體TGm1。在此基礎(chǔ)上，對突變體TGm1中Cys64的15 ?內(nèi)的殘基進(jìn)行虛擬飽和突變及解折疊自由能變計(jì)算，獲得了結(jié)合自由能降低且活性提高的突變體TGm2（比活力是突變體TGm1的1.44倍）。

4 結(jié)論與展望

穩(wěn)定性和催化活性在酶的廣泛應(yīng)用中有著舉足輕重的作用。通過結(jié)構(gòu)修飾的酶工程策略是改善酶特性的一個(gè)理想方法，研究人員能夠根據(jù)需求塑造酶的物理和催化特性。研究表明，通過引入額外的或新的作用力（氫鍵、鹽橋、芳香環(huán)相互作用、疏水相互作用和二硫鍵）、增加脯氨酸、減少甘氨酸及截短柔性區(qū)域等，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)剛性，可獲得滿足實(shí)際應(yīng)用需求的耐受高溫的生物催化劑。而通過降低空間位阻、拓寬催化口袋、增加底物親和力和調(diào)節(jié)活性位點(diǎn)靈活性，則可實(shí)現(xiàn)酶催化功能的高效性和多樣性。但是，在穩(wěn)定性或催化功能改造的過程中，新突變的引入會(huì)削弱其他功能，致使進(jìn)化過程中穩(wěn)定性和催化活性相互制約。為了克服這個(gè)問題，本文通過總結(jié)包括基于理性計(jì)算優(yōu)選突變熱點(diǎn)、基于多重蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或活性改造策略的共進(jìn)化，以及基于高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)骨架創(chuàng)造或/和優(yōu)化蛋白質(zhì)功能等多種策略，探討了同時(shí)提高熱穩(wěn)定性和催化活性的可行性。

目前，蛋白質(zhì)工程主要是針對自然界中現(xiàn)有的酶進(jìn)行改造，以獲得特定催化特性。如何操縱高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，使其能夠更好地容忍賦予新功能所需的突變，成為科研人員面臨的主要挑戰(zhàn)。為了解決這一問題，David Baker 團(tuán)隊(duì)在從頭設(shè)計(jì)酶領(lǐng)域做出了巨大貢獻(xiàn)并取得了突破性進(jìn)展，不僅可以獲得具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)變體，還能減少隨后修復(fù)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的時(shí)間和工作強(qiáng)度，使功能蛋白質(zhì)的“定制”不再是幻想［117-119］。同時(shí)，AlphaFold［120］誕生并在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方面取得了重大成果，使得未解析結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾研究再上新臺(tái)階，為更清晰地認(rèn)識(shí)酶的進(jìn)化、創(chuàng)新生物催化系統(tǒng)翻開新的篇章。