胡疊　唐前君　羅坤　吳秋云　夏志蘭　劉敏

關(guān)鍵詞：姬松茸；粗多糖；煙草花葉病毒；半葉法

中圖分類號：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）為單鏈正義RNA 病毒，經(jīng)接種鑒定統(tǒng)計其寄主多達(dá)350 多種植物，除煙草外，還為害多種經(jīng)濟(jì)作物，例如茄科、十字花科等[1]。生產(chǎn)中病毒粒子的擴(kuò)散和流行速度受溫度、濕度、光照的影響，在高溫和強(qiáng)光環(huán)境下病毒延長潛育期，一旦條件適宜再爆發(fā)病癥。全國各煙區(qū)均有因煙草花葉病造成減產(chǎn)的問題，尤其是云南、貴州煙區(qū)主要受TMV 影響，平均發(fā)病率為20%～30%，嚴(yán)重年份高達(dá)60%～80%，導(dǎo)致毀田和絕收[2]。

天然真菌多糖主要分布在大型真菌子實(shí)體和菌絲中，多個單糖（10 個以上）以糖苷鍵連接組合成螺旋狀高分子多聚物[3]，結(jié)構(gòu)形態(tài)近似于DNA，具有特殊生物活性[4]。經(jīng)過深入研究，研究人員發(fā)現(xiàn)一些真菌中含有多種農(nóng)用活性物質(zhì)[5]。真菌多糖在抑制病菌和病毒、殺線蟲、防治害蟲等方面有良好的效果，已經(jīng)在香菇屬（Lentinus）、蠟傘屬（Hygrophorus）、杯傘屬（Clitocybe）和牛肝菌（Boletus）等菌類中均有發(fā)現(xiàn)[6-8]。張超等[9-10]以平菇、香菇和金針菇子實(shí)體為材料，從中提取的多糖在枯斑寄主莧色藜上對TMV 表現(xiàn)出不等的抑制作用。許玉娟等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)蒼耳多糖處理后的心葉煙，在接種TMV 后，枯斑明顯少于對照組，有效抑制了TMV 浸染，推測蒼耳多糖誘導(dǎo)植株防御酶活性從而抑制病毒。吳艷兵等[11]從體外鈍化、預(yù)防、治療三方面評價了毛頭鬼傘多糖對TMV 的抑制效果，發(fā)現(xiàn)毛頭鬼傘多糖具有較強(qiáng)的預(yù)防侵染作用，可有效預(yù)防TMV病毒病的發(fā)生。香菇多糖為現(xiàn)市面具代表性的真菌多糖農(nóng)藥產(chǎn)品，共登記44 個產(chǎn)品信息，以0.5%～2.0%水劑為主，具有殺菌和植物抗性誘導(dǎo)作用。趙新保[12]研究表明，0.5%香菇多糖水劑用量為18.75～26.25 g/hm² 時，辣椒病毒病防效可達(dá)62.0%～66.5%，并且該藥劑在有效濃度范圍內(nèi)對作物和環(huán)境安全。

隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及生活水平的不斷提高，食品安全意識也逐漸加強(qiáng)，因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色防控技術(shù)的需求增加。真菌多糖是真菌的代謝產(chǎn)物，天然且安全，殘留在環(huán)境中也會被微生物分解，不造成污染。真菌多糖可誘導(dǎo)植物提高抗病性、激發(fā)植物免疫力，可以開發(fā)成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上新型的植物抗病誘導(dǎo)劑，具有非常好的應(yīng)用前景。本研究在提取6 種真菌多糖粗品的基礎(chǔ)上，采用半葉法和綠色熒光標(biāo)記技術(shù)，篩選出抗TMV 效果最好的多糖，研究結(jié)果對作物TMV 的綠色防控具有一定的理論意義和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病毒 煙草花葉病毒（Tobacco mosaicvirus， TMV），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系唐前君老師提供。

1.1.2 供試作物 心葉煙（Nicotiana glutinosa）、普通煙NC-89（N. tabacum var. NC89）、本氏煙（N. benthamiana）、云煙87（N. Yunyan 87），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系唐前君老師提供。

1.1.3 供試藥劑 0.5%香菇多糖水劑，市購，山東圣鵬科技股份有限公司生產(chǎn)；1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑，市購，河南神華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 煙草花葉病毒（TMV）懸浮液制備 取感染病毒的葉片（云煙87）樣品100 g，剪碎置于研缽內(nèi)，加入少許石英石和20 mL 預(yù)冷磷酸緩沖液（0.2 mmol/L， pH 5.7～8.0），充分研磨，過濾；磷酸緩沖液定容至100 mL，制得煙草花葉病毒懸浮液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 真菌粗多糖制備 試驗(yàn)使用6 種真菌子實(shí)體，包括平菇（Pleurotus ostreatus）、姬松茸（Agaricus blazei）、云芝（Coriolus versicolor）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、靈芝（Ganodermalucidum）、桑黃（Phellinus igniarius），粗多糖提取步驟如下[13-15]：（1）在干燥箱37 ℃條件下干燥24 h，將子實(shí)體徹底烘干；（2）上述烘干后的子實(shí)體各取150 g，利用中藥小型粉碎機(jī)打成細(xì)粉，按照水料質(zhì)量比15∶1，各子實(shí)體粉末中加入去離子水，95 ℃水浴6 h 后過濾，濾渣重復(fù)水提一次，收集最終濾液，經(jīng)4000 r/min 高速離心15 min 去除沉淀、循環(huán)真空水泵抽濾3 次，獲得無明顯顆粒雜質(zhì)的濾液，60 ℃ 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀20 r/min 將濾液真空濃縮至原體積的1/5；（3）按體積比1∶1，將配好的sevage 工作試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）加入濃縮濾液中，震蕩30 min后，經(jīng)4000 r/min 高速離心15 min，保留上層多糖溶液，去除下層含蛋白質(zhì)的溶液，重復(fù)離心至下層溶液完全去除干凈；（4）加入4 倍體積的95%乙醇，與濃縮液充分混合，置于4 ℃冰箱靜置21 h，經(jīng)4000 r/min 高速離心15 min，收集沉淀，加入少量去離子水復(fù)溶沉淀，再次醇沉，收集所有沉淀置于37 ℃烘箱放置1 h，除去殘留的乙醇溶液，然后經(jīng)過冷凍干燥儀凍干，得到子實(shí)體粗多糖。

1.2.3 多糖理化性質(zhì)測定 多糖化學(xué)組成測定包括總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸、硫酸基含量。采用苯酚硫酸法測定總糖含量[16]；采用考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)含量[17]；采用硫化鋇-明膠法測定硫酸基含量[18]；采用間羥基聯(lián)苯法測定多糖糖醛酸含量[19]。

1.2.4 抗TMV 粗多糖篩選 藥效測定參照陳年春[20]、逄麗麗等[21]的半葉法。

（1）粗多糖對TMV 的鈍化作用。選取7 葉期長勢一致的心葉煙，TMV 病毒粒子為接種物（按1∶100 稀釋），利用去離子水將粗多糖分別稀釋至6、12、24 mg/mL，病毒分別與多糖溶液1∶1 混合，靜置30 min，采用半葉法摩擦接種到心葉煙的左半葉，右半葉接種去離子水與病毒混合液作對照。每個處理3 株，重復(fù)3 次。將處理后的葉片置于25～28 ℃、濕度70%～80%的條件下5～6 d。記錄形成的枯斑數(shù)，根據(jù)公式計算鈍化率，評定真菌多糖對TMV 的鈍化效果。

式中，C 表示空白對照組的枯斑數(shù)量；T 表示處理組的枯斑數(shù)量。

（2）粗多糖對TMV 的預(yù)防作用。將稀釋為6、12、24 mg/mL 的粗多糖溶液分別噴施到心葉煙葉片半葉，另半片葉噴去離子水作對照，連續(xù)處理3 d。在最后一次噴施24、48 h 后，分別對各處理的葉片全葉接種病毒。然后置于溫室中培養(yǎng)5～6 d。記錄形成的枯斑數(shù)，根據(jù)公式計算預(yù)防率，評定真菌多糖對TMV 的防御效果。

式中，C 表示空白對照組的枯斑數(shù)量；T 表示處理組的枯斑數(shù)量。

（3）粗多糖對TMV 的治療作用。將供試病毒摩擦接種到7 葉期的心葉煙葉片，分別在24、48 h 后，將粗多糖溶液分別噴施到心葉煙葉片半葉，另半片葉噴去離子水作對照，連續(xù)處理3 d。培養(yǎng)5～6 d 記錄形成的枯斑數(shù)，根據(jù)公式計算抑制率，評定粗多糖對TMV 的治療效果。抑制率計算公式如下：

式中，C 表示空白對照組的枯斑數(shù)量；T 表示處理組的枯斑數(shù)量。

1.2.5 五點(diǎn)注射法 由本實(shí)驗(yàn)室保存的TMVGFP農(nóng)桿菌菌株，在含有50 μg/mL Kana 和25 μg/mL Rif LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。5000 r/min 室溫離心10 min，吸取上清液保留沉淀，加入5 mL 侵染液將菌體沉淀重懸，直至菌液OD600 為0.8 左右。28 ℃90 r/min 誘導(dǎo)4 h。侵染液配置見表1。

選取培養(yǎng)1個月左右，生長狀況良好、長勢一致的本氏煙草，用一次性注射器吸取藥劑，避開葉片主脈、次脈選取5 個點(diǎn)，使藥劑連成環(huán)注射煙草葉片背面。用去離子水作對照，3次重復(fù)。24 h 后，在藥環(huán)的中心注射制備的TMV-GFP 農(nóng)桿菌菌液，黑暗培養(yǎng)12 h，光照培養(yǎng)2、5 d 后紫外燈照射，每天觀察熒光斑點(diǎn)擴(kuò)散情況。采用十字交叉法測定熒光斑直徑，計算抑制率。

1.2.6 抗病粗多糖對系統(tǒng)寄主防效測定 將對TMV 防治效果較好的粗多糖稀釋為6、12、24、48 mg/mL， 分別噴施5～7 葉期且長勢一致的NC-89 煙草上，48 h 后接種病毒，各處理40 株，重復(fù)3 次。以清水為陰性對照，1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（60 mg/L）為陽性對照1，0.5%香菇多糖水劑（26.25 mg/mL）為陽性對照2。處理后煙草置于防蟲溫室培養(yǎng)，待陰性對照煙苗明顯發(fā)病后記錄各處理組的發(fā)病情況。

按照病葉級數(shù)，計算各處理的病情指數(shù)。煙草病情分級標(biāo)準(zhǔn)及公式[22]如下：0 級為全株無??；1 級為新葉明脈，少數(shù)葉片輕花葉；3 級為全株1/2 葉片花葉，少數(shù)葉片變形或葉脈變黑；5 級為全株2/3 葉片花葉或有小枯斑，植株矮化，株高為健株1/2，結(jié)果少；7 級為全株葉片花葉或葉片枯斑連片枯死，植株嚴(yán)重矮化，不結(jié)果或結(jié)果畸形。

1.2.7 抗病粗多糖對TMV的大田防效測定 選取長勢一致的煙草共42 行，每行40 株，自然發(fā)病，第1～6 行噴施0.5%香菇多糖水劑（26.25 mg/mL），7～12 行噴施1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（60 mg/L），13～18 行噴施清水，19～24、25～30、31～36、37～42行分別噴施6、12、24、48 mg/mL 姬松茸粗多糖水溶液，每7 d 噴1 次，共噴3 次，試驗(yàn)期間不使用其他藥劑，病葉級數(shù)標(biāo)準(zhǔn)及公式參照1.2.6。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以各試驗(yàn)組防治效果數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，采用Microsoft 365 Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和繪制圖表；采用IBM SPSS Statistics19.0 軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和Pearsons 相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種食用菌的粗多糖組分含量

經(jīng)測定，6 種食用菌多糖中，姬松茸粗多糖提取率最高，達(dá)24.32%，其次為平菇18.56%， 最低為杏鮑菇（表2）?？偺呛恐?，姬松茸總糖顯著高于其他食用菌種類，達(dá)到37.71%，其次是桑黃和靈芝粗多糖總糖含量，均超過32.00%。云芝粗多糖的糖醛酸含量為6.81%，顯著高于其他5種食用菌粗多糖，其次是靈芝粗多糖。姬松茸粗多糖硫酸基含量高達(dá)2.10%，已有研究表明，硫酸基含量影響多糖的許多生物活性功能[23]。

2.2 抗TMV 病毒的粗多糖篩選

通過半葉法測定粗多糖的藥效，結(jié)果如表3所示，6 種食用菌粗多糖對TMV 均具有一定的防治效果。均以噴施多糖溶液48 h 后接種病毒的預(yù)防效果最好，姬松茸、云芝、平菇粗多糖的預(yù)防率可達(dá)到60.00%以上， 尤其姬松茸粗多糖24 mg/mL 處理的預(yù)防效果最好，高達(dá)92.04%；其次是12 mg/mL 姬松茸粗多糖的預(yù)防率為86.91%。6 種食用菌粗多糖對TMV 的治療效果不明顯，除了接種病毒24 h 后噴施24 mg/mL 姬松茸粗多糖的治療效果可達(dá)到44.53%以外，其余處理的預(yù)防效果均低于42.00%。食用菌多糖對TMV 的鈍化效果比預(yù)防效果差，除24 mg/mL 平菇粗多糖處理組鈍化率為62.41%，其他均低于60.00%。不同時間姬松茸粗多糖處理葉片對TMV 的預(yù)防效果存在差異，處理48 h 后葉片的預(yù)防效果優(yōu)于處理24 h 后。粗多糖的使用濃度和處理方式對防治效果均有一定影響，部分粗多糖在相同濃度不同施藥方式下對病毒的抑制效果不同，此外，相同施藥方式的抑制效果也并未隨施藥濃度的增加而提高。

2.3 綠色熒光蛋白標(biāo)記試驗(yàn)

將24 mg/mL 姬松茸粗多糖按照五點(diǎn)注射法流程處理煙草，黑暗培養(yǎng)12 h 后注射點(diǎn)綠色熒光蛋白的表達(dá)隨著時間的推進(jìn)，熒光點(diǎn)的大小、強(qiáng)弱均發(fā)生變化（圖1A，圖1D），這間接反映了病毒的分布、擴(kuò)散和增殖情況。在光照培養(yǎng)2 d后， 粗多糖處理組的熒光斑直徑（ 平均直徑0.83 cm）明顯小于去離子水對照組（平均直徑1.18 cm），抑制率為29.66%（圖1B，圖1E）。并且光照培養(yǎng)5 d 時，粗多糖處理后的熒光斑點(diǎn)亮度弱于對照組（圖1C，圖1F），說明其在病毒侵染前期對TMV 的增殖有抑制作用，明顯可看出對照組熒光區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大（ 平均直徑1.65 cm），熒光點(diǎn)開始明顯向葉片其他區(qū)域移動，新葉上發(fā)現(xiàn)少量熒光點(diǎn)，光照培養(yǎng)5 d，粗多糖處理組（平均直徑1.02 cm）與光照培養(yǎng)2 d 時相比，熒光區(qū)域變化不大且新葉未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，抑制率為38.18%。表明姬松茸粗多糖延緩了TMV 的移動速度，減緩系統(tǒng)侵染進(jìn)程。

2.4 姬松茸粗多糖對系統(tǒng)寄主的防效

姬松茸粗多糖在系統(tǒng)寄主NC-89 上對TMV有一定的防治效果（表4）。與對照相比，處理組煙苗的病情指數(shù)明顯降低，6、12、24 mg/mL姬松茸粗多糖對病毒的相對防效均在52.00%以上，在48 mg/mL 濃度時植株出現(xiàn)損傷，多糖濃度過高在植株表面形成沉淀，引起植株黃化。當(dāng)粗多糖濃度為24 mg/mL 時，對TMV 的防治效果高達(dá)76.81%，其防治效果略高于0.5%香菇多糖水劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑處理組。姬松茸多糖能有效防治TMV，延遲植株發(fā)病，有利于煙草的生長。

2.5 姬松茸粗多糖對TMV 的大田防效試驗(yàn)

在發(fā)病煙草田中第3 次噴灑24 mg/mL 姬松茸粗多糖溶液后7 d，對TMV的防治效果為70.31%，略低于0.5%香菇多糖水劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑處理組（表5）。48 mg/mL 姬松茸粗多糖溶液在第2 次施藥后，植株出現(xiàn)黃化，局部葉片壞死的情況。姬松茸粗多糖對TMV 的防治效果十分顯著，對葉片扭曲、卷縮、停止生長的植株有明顯改善，病情指數(shù)低的植株完全能夠恢復(fù)正常。同時對TMV 有一定的抑制作用，噴施過姬松茸粗多糖的煙草發(fā)病時間延后，煙草長勢良好，葉片伸展，而噴施清水的植株明顯矮化，葉片發(fā)黃。

3 討論

已有研究得出糖醛酸含量較高的多糖具有某些特殊生理活性，一般高含量糖醛酸多糖大多出現(xiàn)在植物類多糖中[24]。本研究得出，云芝粗多糖的糖醛酸含量為6.81%，顯著高于其他5 種食用菌多糖，高于劉瑋[25]研究的糖醛酸含量，其原因可能是原材料的品種、產(chǎn)地及栽培方式不同導(dǎo)致的。硫酸基含量指多糖結(jié)構(gòu)中所帶的硫酸基的個數(shù)，本研究測得姬松茸粗多糖硫酸基含量高達(dá)2.10%，施婭楠等[23]研究得出，多糖的許多生物活性功能與硫酸基含量有直接關(guān)系，導(dǎo)致多糖的抗氧化性存在差異，進(jìn)而可能影響其抗病毒或抑菌能力。如BACH 等[26]通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2，2′-聯(lián)氮雙-二胺鹽（ABTS）法測定不同真菌提取物的抗氧化能力，觀察到DHHP 法中的抗自由基活性依次為：巴西蘑菇>雙孢蘑菇>香菇>金針菇，ABTS 法中依次為：巴西磨菇>雙孢蘑菇>金針菇>香菇。

煙草花葉病毒（TMV）依賴寄主提供的場所、底物和酶等一系列物質(zhì)在寄主活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制和裝配[26-28]。真菌多糖不僅能針對病毒粒子，也能作用于寄主植株，誘發(fā)寄主抗病性[29]。真菌多糖對煙草花葉病有一定的抑制作用，噴施多糖溶液48 h 后接種TMV 的預(yù)防效果較好，姬松茸、云芝、平菇粗多糖的預(yù)防效果均達(dá)到60.00%以上。尤其是24 mg/mL 姬松茸粗多糖處理的預(yù)防效果最好，高達(dá)92.04%。從總體來看，真菌多糖對TMV 的預(yù)防效果較好，與沈小英等[30]的研究結(jié)果一致，其他報道的掃把菌、奶漿菌、安絡(luò)小皮傘和火碳菌等多糖對TMV 的防治效果超過80%[31]。從產(chǎn)品的生產(chǎn)成本來看，人工種植菌株更有優(yōu)勢。

室內(nèi)試驗(yàn)表明，姬松茸粗多糖的防治效果稍優(yōu)于香菇多糖，而大田試驗(yàn)防效略低，與標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥產(chǎn)品相比，由于技術(shù)上的差異，姬松茸多糖水溶液的穩(wěn)定性和純度不夠。施藥方式不同，姬松茸多糖均能相應(yīng)緩解植株的病情，但防治效果有差異，這可能與姬松茸多糖的作用方式有多指向性，既能切斷病毒與細(xì)胞的結(jié)合，還能抑制病毒復(fù)制，或保護(hù)寄主植株有關(guān)。