稅軍　劉小強　陳青　梁 曉　伍春玲　劉迎　姚曉文　喬陽　毛立杰　陳銀華

關(guān)鍵詞：桃蚜；抗、感辣椒品種；密度；取食時間；茉莉酸；合成途徑；信號途徑；基因表達

中圖分類號：S436.418.2 文獻標(biāo)識碼：A

辣椒（Capsicum annuum L.）近年來逐步成為我國產(chǎn)值最高的蔬菜作物，年總產(chǎn)值超700億元。我國是世界上種植辣椒面積最大的國家，2020 年辣椒播種面積約占世界播種總面積的40%[1]。2020 年海南辣椒生產(chǎn)占其瓜菜播種總面積的13.1%[2]，辣椒產(chǎn)業(yè)是熱帶特色高效農(nóng)業(yè)、鄉(xiāng)村振興及南繁種業(yè)發(fā)展中的重要組成部分。

桃蚜（Myzus persicae Sulzer）是世界上分布最廣的蚜蟲之一，以口針吸食寄主植物幼嫩組織汁液，并排泄蜜露，誘發(fā)煤污病，而且可傳播115 種植物病毒[3]。桃蚜在海南辣椒上，一年可發(fā)生20 代以上[4]，世代重疊且快速繁殖，嚴(yán)重威脅茄科辣椒屬作物的生產(chǎn)安全。海南省作為南方冬季辣椒北運主產(chǎn)區(qū)之一，伴隨著該地區(qū)辣椒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，桃蚜的為害愈發(fā)嚴(yán)重。當(dāng)前登記防蚜藥劑種類較少，大劑量高頻率不合理的藥劑防治所導(dǎo)致的農(nóng)產(chǎn)品安全、產(chǎn)地環(huán)境安全和抗藥性等問題十分突出。因此，亟需尋找新的桃蚜防控策略和途徑。

誘導(dǎo)抗性（induced resistance， IR）介導(dǎo)的防御反應(yīng)在植物抵御植食性昆蟲取食為害中發(fā)揮重要作用，是害蟲綠色防控治理體系中極為重要的一項舉措[5]，其介導(dǎo)的防御反應(yīng)主要通過茉莉酸（JA）途徑來完成[6]。JA 作為脂質(zhì)抗性激素在植物抵御害蟲脅迫的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]，害蟲取食會激活植物JA 合成途徑，促進JA 含量的積累，進一步誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)相關(guān)信號途徑基因，從而導(dǎo)致植物其他抗蟲性物質(zhì)含量的積累，進而提高植物對害蟲的抗性[7]。JA 的合成起源于α-亞麻酸（α-LeA），脂氧合酶（LOX）催化α-亞麻酸并控制JA 合成的第一步。當(dāng)昆蟲取食或為害植物時，植物體內(nèi)脂氧合酶基因LOX 被激活，誘導(dǎo)JA合成和積累，而生成的JA 又可進一步激活LOX基因[8]。丙二烯氧化物合成酶（AOS）是JA 合成的第2 個關(guān)鍵酶，受JA 的反饋調(diào)節(jié)，昆蟲取食可激活A(yù)OS 基因的啟動子，造成其在植物體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)表達[9]。丙二烯氧化物環(huán)化酶（AOC）在番茄機械損傷誘導(dǎo)信號中起著關(guān)鍵作用，番茄植株受傷后誘導(dǎo)AOC 在植株體內(nèi)表達迅速上升[10]，表明AOC 可能參與JA 合成。OPDA 還原酶（OPR）相關(guān)基因OPR3 的轉(zhuǎn)錄受JA 誘導(dǎo)，JA 誘導(dǎo)條件下能促進OPR3 基因表達[11]。JAR1 催化JA 形成共軛物JA-Ile[12]，參與JA 信號級聯(lián)傳遞。在擬南芥的酵母免疫沉淀實驗中證明泛素蛋白（COI1）可能是JA-Ile 的受體[13]。在存在JA-Ile 的情況下，JAZ 蛋白通過Jas 結(jié)構(gòu)域與COI1 結(jié)合，JAZ 蛋白隨后被降解，NINJA-TPL 復(fù)合物與MYC2 轉(zhuǎn)錄因子分離，從而啟動JA 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，參與植物JA 信號途徑介導(dǎo)的防御反應(yīng)（圖1）。

迄今為止，對于桃蚜與辣椒互作時，是否影響JA 合成及信號途徑基因表達的蚜口密度和取食時間效應(yīng)仍不明確。本研究以抗、感蚜辣椒品種為參試材料，系統(tǒng)比較分析不同密度桃蚜取食不同時間后，JA 合成及信號途徑基因的表達量在抗、感辣椒品種中的變化趨勢及其在抗、感蚜辣椒品種間的差異，以初步明確引起抗、感蚜辣椒品種JA 合成及信號途徑基因顯著差異表達的蚜口密度和取食時間范圍，為闡明JA 合成及信號途徑在辣椒抗蚜性中的重要作用以及抗蚜辣椒種質(zhì)資源鑒定評價提供理論依據(jù)與參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 供試桃蚜 以煙草（Nicotiana tabacum L.）長期室內(nèi)繼代飼養(yǎng)（>54 代）于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所特色熱帶害蟲實驗室。飼養(yǎng)條件為：溫度（24±2）℃，相對濕度為75%±5%，光照為16 h /8 h（L/D）。選擇發(fā)育歷期相同、大小一致的無翅雌成蚜開展后續(xù)實驗。

1.1.2 供試?yán)苯?抗蚜辣椒種質(zhì)豬大腸（ZDC）、感蚜辣椒種質(zhì)大羊角椒（DYJJ）抗性遺傳穩(wěn)定由本實驗室提供，抗、感蚜辣椒品種皆屬于長辣椒變種（Capsicum annuum L. var. longum Bailey）。供試豬大腸和大羊角椒辣椒以種子進行有性繁殖，統(tǒng)一育苗，條件設(shè)置為：溫度24 ℃，光照為16 h/8 h（L/D），相對濕度70%±5%。育苗后3～4片真葉時移栽幼苗至含種植土（土壤∶泥炭土∶珍珠巖=1∶1∶1）的育苗盆中，每周澆水2～3 次，8 周后選取生長發(fā)育狀況基本一致的健康植株用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 JA 合成及信號途徑基因選擇 根據(jù)KEGG 網(wǎng)站（https：//www.kegg.jp/kegg/）中已經(jīng)發(fā)布的JA 合成及信號通路，并結(jié)合相關(guān)的文獻報道，選取在植物JA 合成及信號調(diào)控研究中最為廣泛的6 個基因作為候選基因，用于辣椒JA 合成及信號基因表達差異與辣椒抗蚜性的相關(guān)顯著性分析，分別為LOX2（脂氧合酶基因）、AOS（丙二烯氧化物合成酶基因）、AOC（丙二烯氧化物環(huán)化酶基因）、OPR3（OPDA 還原酶基因）、COI1（泛素蛋白連接酶基因）、JAR1（茉莉酸－異亮氨酸合成酶基因）。

1.2.2 辣椒接蟲與取樣 辣椒移栽8 周后，選取長勢基本一致的豬大腸和大羊角椒植株用于實驗。每株辣椒選取上部發(fā)育成熟和葉片大小相對一致的3 張葉片，用毛筆從煙草上小心挑取桃蚜雌成蟲接于葉背。使用蚜蟲生態(tài)盒輕輕地夾住葉片，使得葉片的正常生理活動不受影響，并且保證桃蚜不遷移（圖2）。以未接桃蚜前的辣椒植株相同部位葉片為對照，每張葉的桃蚜密度分別設(shè)置為20、30、40、50、60 蚜/葉，每個桃蚜密度和蚜害時間均設(shè)置3 個重復(fù)。分別在未接桃蚜前（0 h）、接桃蚜后6、12、24、48、72 h 的6 個時間點采集葉片。

1.2.3 RNA 提取及cDNA 第一條鏈的合成 參照植物總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，美國）說明書提取辣椒葉片RNA，利用D2000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量Ladder（Solarbio，中國）和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度和完整性。取1.0 μg RNA經(jīng)ToloScript RT EasyMix for qPCR 試劑（TOLOBIO，中國）消除gDNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR 分析 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的辣椒JA 信號途徑基因LOX2、AOS、AOC、OPR3、COI1 和JAR1 序列設(shè)計qPCR 引物（表1）。cDNA 樣品經(jīng)RNase-free ddH2O 稀釋5倍后作為qPCR 的模板，以辣椒CaActin 作為內(nèi)參基因（表1）。qPCR 反應(yīng)體系的配制參照2 × Q3SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（TOLOBIO，中國）。qPCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 次循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。使用LightCycler? 96 儀器（Roche，瑞士）程序采集溶解曲線。分別以未受蚜害的辣椒JA 合成及信號途徑基因的表達量歸一化設(shè)置為1.0，蚜害后的JA基因的表達量變化情況以為害前的相對倍數(shù)表示，以LIVAK 等[16]的2?ΔΔCT 方法計算分析，每個處理均設(shè)置3 個生物重復(fù)，每個生物重復(fù)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 軟件進行數(shù)據(jù)匯總整理，使用統(tǒng)計學(xué)軟件DPS（V15.10）進行不同蚜口密度和不同為害時間的基因表達量差異分析， 采用Duncans 新復(fù)極差法方法進行數(shù)據(jù)間的多重比較（顯著性水平均為P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 LOX2 表達量差異分析

抗、感蚜辣椒品種在不同密度及不同時間下被桃蚜取食后JA 合成途徑基因LOX2 表達量變化差異顯著（圖3）。除ZDC 在40 蚜口密度外，隨蚜口密度的增加和為害時間的延長，抗、感蚜辣椒品種LOX2 表達量在總體上均呈先顯著上升再顯著后下降的趨勢；除60 蚜口密度外，抗、感蚜品種中LOX2 表達量均在不同為害密度的同一為害時間下達到峰值；其中抗、感蚜品種中LOX2表達量均在30 蚜口密度下為害48 h 達到峰值，較對照分別增長11.79 倍及10.96 倍（圖3A、圖3B）。進一步比較抗、感品種之間LOX2 的表達量差異，發(fā)現(xiàn)在20、50 及60 蚜口密度下，ZDC 表達量顯著低于DYJJ，而在30 及40 蚜口密度下，ZDC 表達量顯著高于DYJJ（圖3C）。

2.2 AOS 表達量差異分析

抗、感蚜辣椒品種在不同密度及不同時間下被桃蚜取食后JA 合成途徑基因AOS 表達量變化差異顯著（圖4）。除40 蚜口密度外，隨蚜口密度的增加和為害時間的延長，抗、感蚜辣椒品種AOS 表達量在總體變化趨勢上基本一致；在50蚜口密度下，抗、感品種表達量差異最顯著，均在為害6 h 達到峰值，較對照分別增長6.91 倍及14.27 倍（圖4A、圖4B）。進一步比較抗、感品種之間AOS 的表達量差異，發(fā)現(xiàn)除50 蚜口密度外，其余蚜口密度下ZDC 表達量均顯著高于DYJJ（圖4C）。

2.3 AOC 表達量差異分析

抗、感蚜辣椒品種在不同密度及不同時間下被桃蚜取食后JA 合成途徑基因AOC 表達量變化差異顯著。除40 蚜口密度外，隨蚜口密度的增加和為害時間的延長，抗、感蚜辣椒品種AOC 表達量在總體變化趨勢上基本一致，呈顯著上升再顯著下降，再略微回調(diào)最終下降的趨勢；其中抗、感蚜品種中AOC 表達量均在30 蚜口密度下為害6 h 達到峰值，較對照分別增長1.34 倍及1.41 倍；（圖5A、圖5B）。進一步比較抗、感、品種之間AOC 的表達量差異，發(fā)現(xiàn)在20、30、40、50 和60 蚜口密度下，ZDC 表達量均顯著高于DYJJ（圖5C）。

2.4 OPR3 表達量差異分析

抗、感蚜辣椒品種在不同密度及不同時間下被桃蚜取食后JA 合成途徑基因OPR3 表達量變化差異顯著（圖6）。隨蚜口密度的增加和為害時間的延長，抗、感蚜辣椒品種OPR3 表達量在總體上均呈先顯著上升再顯著下降的趨勢；除50 及60 蚜口密度外，抗、感蚜品種中OPR3 表達量均在不同為害時間下達到峰值；其中抗、感蚜品種中OPR3 表達量均在50 蚜口密度下為害6 h 達到峰值，較對照分別增長1.31 倍及7.92 倍（圖6A、圖6B）。進一步比較分析抗、感品種之間OPR3的表達量差異，發(fā)現(xiàn)在20、50 及60 蚜口密度下，ZDC 表達量顯著低于DYJJ，而在30 及40 蚜口密度下，ZDC 表達量顯著高于DYJJ（圖6C）。

2.5 COI1 表達量差異分析

抗、感蚜辣椒品種在不同密度及不同時間下被桃蚜取食后JA 信號途徑基因COI1 表達量變化差異顯著。隨蚜口密度的增加和為害時間的延長，抗、感蚜辣椒品種COI1 表達量在總體變化趨勢上基本一致，呈現(xiàn)先下降后上升最終下降；在40蚜口密度下，抗感品種表達量差異最顯著，均在為害24 h 達到谷值，比對照分別降低0.52 倍及2.73 倍（圖7A、圖7B）。進一步比較抗、感品種之間COI1 的表達量差異，發(fā)現(xiàn)在50 蚜口密度下，ZDC 表達量均顯著高于DYJJ，而在20、30、40及60 蚜口密度下，ZDC 表達量均顯著低于DYJJ（圖7C）。

2.6 JAR1 表達量差異分析

抗、感蚜辣椒品種在不同密度及不同時間下被桃蚜取食后JA 信號途徑基因JAR1 表達量變化差異顯著（圖8）。隨蚜口密度的增加和為害時間的延長，抗、感蚜辣椒品種JAR1 表達量在總體變化趨勢上基本一致，呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢；在60 蚜口密度下，抗、感品種表達量差異最顯著，均在為害72 h 達到谷值，較對照分別降低1.83倍及1.75 倍（圖8A、圖8B）。進一步比較抗、感品種之間JAR1 的表達量差異，發(fā)現(xiàn)在各個蚜口密度下，ZDC 表達量均顯著低于DYJJ（圖8C）。

3 討論

JA 介導(dǎo)的應(yīng)對植食性昆蟲的防御途徑在植物免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]，JA 是誘導(dǎo)作物體內(nèi)系統(tǒng)抗性產(chǎn)生抗蟲反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子，JA 信號通路又在植物防御的激活中起著主導(dǎo)作用，且JA 合成及信號防御途徑由多基因控制[18-19]。植物主要通過JA 途徑介導(dǎo)的防御反應(yīng)抵御刺吸式害蟲，刺吸式害蟲的蟲口密度和為害時間能顯著影響作物JA 合成途徑基因的表達[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗、感蚜辣椒品種在不同蚜口密度為害下，LOX2 表達量均呈現(xiàn)先顯著升高后隨為害時間的延長逐漸恢復(fù)至為害前水平。LOX 基因表達量呈現(xiàn)相似的變化。同樣在馬鈴薯蚜蟲取食番茄葉片和桃蚜取食擬南芥葉片[21]，桃蚜取食抗、感辣椒葉片[22]以及二斑葉螨取食抗、感木薯品種[23]中得以報道。這些研究表明LOX2 基因作為JA 合成中途徑的上游調(diào)控基因在植物應(yīng)答昆蟲取食為害中發(fā)揮重要作用。在抗、感大豆材料抗蟲差異中研究發(fā)現(xiàn)，大豆的抗性差異可能與AOS基因的表達密切相關(guān)[24]。AOS 基因可能參與了水稻抗二化螟、稻縱卷葉螟、褐飛虱的防御反應(yīng)，沉默獲得的AOS 水稻品系及其T1 代種子證明了AOS 在水稻抗蟲防御中起到了積極防御作用[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，AOS 基因表達量在抗、感蚜辣椒品種中隨為害時間的延長呈現(xiàn)明顯的先上升后降低的趨勢；50 蚜口密度下為害6 h 時感蚜辣椒品種相比對照增長14 倍之多，隨后劇烈下降，表明感蚜品種DYJJ 體內(nèi)AOS 基因在應(yīng)對桃蚜的取食為害時轉(zhuǎn)錄水平變化劇烈，這可能是感蟲品種中JA初始含量較低，為了應(yīng)對抑制蚜害的需要從而通過AOS 基因的快速上調(diào)最終響應(yīng)其體內(nèi)JA 快速合成，但這種高水平的轉(zhuǎn)錄并不持久。本研究中，在不同蚜口密度下，抗蚜辣椒品種的AOC 表達量相對感蚜品種隨為害時間的延長下降速度較為緩慢，且在抗蚜品種中表達量顯著高于感蚜品種。與AOC 在甘蔗抗粘蟲的表達研究中基本一致[26]。在本研究中OPR3 均隨為害時間的延長，在感蚜辣椒品種DYJJ 中的表達量顯著低于抗蚜品種ZDC。在水稻抗蟲性研究中也發(fā)現(xiàn)OPR3 在中抗水稻品種中能夠過量表達，增強對二化螟的抗性，OPR3 的轉(zhuǎn)錄受JA 誘導(dǎo)，在創(chuàng)傷等能夠誘導(dǎo)JA的脅迫反應(yīng)，而且也能促進OPR3 基因表達[27]。水稻COI1 基因沉默的突變株實驗表明了其COI1基因在水稻防御反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)COI1 和JAR1 的表達量在抗蟲品種中顯著低于感蟲品種，可能COI1 和JAR1 在抗、感應(yīng)答桃蚜取食為害中具有較高的協(xié)同作用，桃蚜取食為害對抗蚜辣椒品種的COI1 和JAR1 基因表達抑制作用較強，推測該基因可能在辣椒對桃蚜的防御反應(yīng)中也扮演重要角色。

通過分析上述6 個JA 途徑基因表達量，發(fā)現(xiàn)桃蚜取食抗、感辣椒品種在不同蚜口密度和為害時間下，JA 合成途徑相關(guān)基因LOX2、AOS、AOC、OPR3 在抗蚜辣椒品種ZDC 中的表達量總體上顯著高于感蚜品種DYJJ。推測JA 合成途徑基因調(diào)控介導(dǎo)的防御反應(yīng)在抗蟲品種ZDC 中可能比感蚜品種DYJJ 的應(yīng)答桃蚜取食為害時作用更直接、強烈。與之相似的，有研究表明煙粉虱在不同蟲口密度下取食抗、感辣椒品種植株時，抗性品種內(nèi)LOX 及AOC 的表達量也顯著高于感蟲品種[29]。此外，同一蚜口密度下各個基因表達量的峰值和谷值在抗、感辣椒品種中出現(xiàn)的時間基本一致，但隨著蚜口密度的上升，抗、感辣椒品種各基因表達量峰值的出現(xiàn)在時間上均有明顯前移的趨勢，推測可能隨著桃蚜蟲口數(shù)量的上升，對植物迅速產(chǎn)生了更強烈的脅迫壓力，導(dǎo)致在較高蚜口密度下辣椒JA 途徑基因表達量的峰值出現(xiàn)在較早為害時間內(nèi)。這一結(jié)果與WANG 等[30]的研究相似，即高水平的食草強度將持續(xù)增加植物初始誘導(dǎo)抗性。

本研究初步闡明了基于JA 合成及信號途徑的辣椒抗蚜性分子機理，同時表明AOS、AOC 及JAR1 基因可能具有作為鑒定評價辣椒抗蚜性水平的分子指標(biāo)的潛力以及為辣椒抗蚜種質(zhì)資源評價與創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。然而，本研究僅比較了單個抗蚜和感蚜辣椒品種之間的基因表達差異，上述評價指標(biāo)在抗、感蚜辣椒品種群體中是否具有通用性和適應(yīng)性仍需進一步證實。