陳艷梅 王 川 劉亭亭 糜自豪 孫樂樂 趙 晴 王 娜 李麗宸 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟(jì)南,250022

天皰瘡(pemphigus)是由抗橋粒芯糖蛋白(desmogleins,Dsg)IgG抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病,主要類型有尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris,PV)和落葉型天皰瘡(pemphigus foliaceus,PF)。目前天皰瘡的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡釋清楚,但是產(chǎn)生自身致病性抗體的B淋巴細(xì)胞無疑在其中起到了關(guān)鍵作用,除此之外,B淋巴細(xì)胞還可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生以及具有抗原遞呈作用,從而將先天免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來[1]。B淋巴細(xì)胞的激活與分化受到多種因素的調(diào)控,其中外源性和內(nèi)源性的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)配體,如脂多糖和HMGB1,都可以通過TLR4/MD2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活B細(xì)胞[2,3];低氧條件下,趨化因子受體4型(C-X-C chemokine receptor type 4 ,CXCR4)通過核因子樣蛋白2(NRF2)和低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α協(xié)同促進(jìn)B細(xì)胞活性[4],說明CXCR4和TLR4對B細(xì)胞的發(fā)育及激活具有重要作用。CXCR4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)B細(xì)胞上呈高表達(dá)[5],TLR4在天皰瘡患者皮損部位表達(dá)增加[6],TLR4+CXCR4+漿細(xì)胞在SLE患者外周循環(huán)中增多并且推動系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎的發(fā)生[7]。由上可知,作為可能調(diào)控自身抗體產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,TLR4和CXCR4在天皰瘡病理機(jī)制的作用知之甚少,本研究旨在探索TLR4和CXCR4在天皰瘡皮損及外周漿細(xì)胞中的表達(dá),分析其在天皰瘡發(fā)病中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2021年6～12月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院皮膚科收治的未經(jīng)免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物治療的,經(jīng)臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)、免疫病理學(xué)、特異性抗體檢測診斷的15例天皰瘡患者作為病例組,其中男8例,女7例,平均年齡(43.6±13.7)歲,另選取13名排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染等疾病的正常人作為對照組,其中男9名,女 4名,平均年齡(45.1±8.5)歲。天皰瘡患者和健康對照臨床和人口學(xué)特征見表1。

表1 天皰瘡患者和健康對照臨床和人口學(xué)特征

1.2 研究方法

1.2.1 流式細(xì)胞檢測 收取的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用含10%胎牛血清(FBS)的完全RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至2×106/mL。取常用規(guī)格的流式管,每管加入1000 μL細(xì)胞懸液(2×106個細(xì)胞)。將之室溫條件下300 g離心5 min,收集細(xì)胞沉淀?xiàng)壣锨濉⒓?xì)胞以20% FBS的PBS緩沖液重懸,按照抗體說明書的要求在細(xì)胞懸液中加入FITC-抗Lin(CD3/14/16/19/20)抗體、PerCP-抗CD27抗體、BV650-抗CD138抗體、APC-抗CD38抗體、BV421-抗CD184(CXCR4)抗體和PE-抗CD284(TLR4)抗體(抗體均購自于BD公司),室溫條件下避光孵育15 min。然后按照上述條件進(jìn)行離心,利用PBS緩沖液重懸細(xì)胞,離心收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)洗滌后用500 μL PBS重懸,然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaTMFusion)上機(jī)分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 對10%福爾馬林固定和石蠟包埋的活檢標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。對每個標(biāo)本,切5微米厚的連續(xù)切片,在75℃孵育60 min。切片在二甲苯中脫蠟,通過100%、95%和75%的分級酒精水合,用蒸餾水洗滌,然后進(jìn)行過氧化物酶阻斷和蛋白質(zhì)阻斷,切片5% BSA封閉液處理60 min, 主要抗體為小鼠抗人TLR-4單克隆抗體(分類號ab22048,英國劍橋Abcam)和兔抗人CXCR-4單克隆抗體(Abcam;ab124824),將針對TLR4、CXCR4的抗體分別稀釋至1∶200和1∶500。在4℃與一抗孵育一夜后,PBS洗滌后利用第二抗體增強(qiáng)劑和二抗孵育30 min。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)輔助顯影。最后,切片放置于蘇木素中孵育,并通過乙醇和二甲苯脫水,封片后利用多光譜病理分析系統(tǒng)進(jìn)行分析觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics軟件進(jìn)行分析,進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計之前檢驗(yàn)兩組之間符合正態(tài)分布,兩組之間差異性比較采用“兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)”方法,相關(guān)性分析采用“斯皮爾曼相關(guān)分析”方法,P<0.05時即證明兩組存在統(tǒng)計學(xué)差異。作圖用Prism軟件和Adobe illustrator軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 天皰瘡患者皮損部位和健康對照TLR4、CXCR4表達(dá)水平分析 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,天皰瘡患者皮損部位TLR4、CXCR4表達(dá)水平明顯高于對照組皮膚組織(圖1)。就表達(dá)部位而言,對照組TLR4主要表達(dá)于皮膚組織表皮基底層(圖1a),而天皰瘡患者皮損部位TLR4主要表達(dá)于表皮基底層和基底層上,甚至表皮淺層(圖1a);對照組CXCR4主要表達(dá)于皮膚組織表皮基底層(圖1b),而天皰瘡患者皮損部位CXCR4主要表達(dá)于表皮基底層和基底層上(圖1b)。

1a:天皰瘡患者皮損部位TLR4表達(dá)水平明顯高于對照組皮膚組織;1b:天皰瘡患者皮損部位CXCR4表達(dá)水平明顯高于對照組皮膚組織

2.2 天皰瘡患者與健康對照外周循環(huán)中TLR4+CXCR4+漿細(xì)胞比例分析 我們先以Lin-CD27+進(jìn)行圈門,然后收集CD38+CD138+漿細(xì)胞。分析顯示,與健康人相比(1.38±0.89),天皰瘡患者外周血PBMC中漿細(xì)胞(Lin-CD27+CD38+CD138+)的表達(dá)比例(3.26±1.90)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2a、2b);然后我們在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步收集TLR4+CXCR4+雙陽細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者漿細(xì)胞中TLR4+CXCR4+雙陽細(xì)胞表達(dá)比例(14.23±8.69)與健康對照(6.74±2.95)相比增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2c、2d。

2a、2b:天皰瘡患者外周血PBMC中漿細(xì)胞(Lin-CD27+CD38+CD138+)的表達(dá)比例增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2c、2d:天皰瘡患者漿細(xì)胞中TLR4+CXCR4+雙陽細(xì)胞表達(dá)比例增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

3 討論

天皰瘡是一種自身抗體導(dǎo)致的皮膚疾病,可在患者血清檢測出Dsg1和Dsg3特異性自身抗體IgG,這些抗體由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,是引起棘層細(xì)胞松解、皮膚、黏膜出現(xiàn)水皰的關(guān)鍵因素。B淋巴細(xì)胞的發(fā)育、分化與激活受多種因素的調(diào)控,例如B細(xì)胞激活因子(BAFF)、CD40-CD40L、B細(xì)胞表面受體信號等[8]。

TLRs是一類天然免疫受體,可直接識別結(jié)合病原相關(guān)分子模式,引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放,并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)[9]。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關(guān)蛋白,幾乎分布于所有的細(xì)胞系,主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞上,如淋巴細(xì)胞。隨著研究的不斷深入,TLR4越來越多的生物學(xué)功能被發(fā)現(xiàn),主要包括可誘導(dǎo)免疫炎性因子的合成和釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng);促進(jìn)免疫細(xì)胞膜表面表達(dá)相關(guān)免疫分子,加速免疫細(xì)胞的成熟和功能化,誘發(fā)特異性免疫;引發(fā)胞內(nèi)殺菌機(jī)制并協(xié)助機(jī)體對病毒的清除;與其它TLRs分子協(xié)同作用,相互影響對病原相關(guān)分子模式的識別[10,11]。TLR4被證明是所有TLRs中最復(fù)雜的信號排列,激活MAL-MYD88通路來誘導(dǎo)NF-κB信號或者激活TRAM-TRIF通路來誘導(dǎo)IRF3信號[12]。一旦激活,TLR4可以上調(diào)炎性細(xì)胞因子和趨化因子,并參與一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路,以調(diào)節(jié)宿主炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、幅度或持續(xù)時間[13]。最近的研究表明,TLR4信號通路的過度激活與SLE和系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。 伴侶分子(Gp96)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中TLR4信號的增加可以誘導(dǎo)狼瘡樣自身免疫性腎炎[15],說明TLR4信號的增加本身就是誘發(fā)自身免疫性疾病的充分和有效的觸發(fā)因素。此外,TLR4基因缺陷的小鼠表現(xiàn)出邊緣帶B細(xì)胞和參與狼瘡疾病發(fā)展的細(xì)胞因子均顯著減少[16]。Sun等發(fā)現(xiàn),天皰瘡患者皮損部位TLR4表達(dá)顯著增加[6]。

趨化因子是細(xì)胞因子超家族中一類具有趨向細(xì)胞定向移動的蛋白多肽,分為CXC、CX3C、CC、C等4類,作用于T細(xì)胞[17]和B細(xì)胞[18]。CXCR4是趨化因子CXCL12[chemokine (C-X-C motif)ligand 12,CXCL12]的受體,在體內(nèi)包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的多種細(xì)胞上廣泛表達(dá),屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族,是由352個氨基酸編碼的高度保守的G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜蛋白受體,與HIV感染、癌癥、造血干細(xì)胞的增殖、分化、歸巢有關(guān)。CXCL12是CXCR4的唯一配體,CXCL12/CXCR4參與B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的生成[19],整合蛋白的激活與趨化作用[17],CXCL12/CXCR4通路能夠促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟,并參與表皮樹突細(xì)胞及朗格漢斯細(xì)胞向真皮遷移,從而啟動相應(yīng)的免疫應(yīng)答[20-22],是一對與自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)的受體和配體。CXCR4在多種狼瘡鼠模型中高表達(dá),特別是在B細(xì)胞和漿細(xì)胞等細(xì)胞上的表達(dá)水平上調(diào)[23];CXCL12 在狼瘡小鼠多種器官中的水平也升高[24];一些研究指出,CXCR4在幾種自身免疫性疾病的炎癥條件下,如多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮了白細(xì)胞趨化作用[25]。此外,在大皰性類天皰瘡中,CXCL12與B細(xì)胞上CXCR4的結(jié)合通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc而導(dǎo)致B細(xì)胞分化和自身抗體的產(chǎn)生[1];CXCL12和CXCR4在大皰性類天皰瘡皮損中呈陽性表達(dá)[26]。

Ma等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血中,TLR4+CXCR4+漿細(xì)胞比例顯著升高。通過將系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠體內(nèi)TLR4+CXCR4+漿細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Rag2缺陷的小鼠中,促進(jìn)了Rag2缺陷小鼠自身抗體的產(chǎn)生及腎小球性腎炎的發(fā)展,證實(shí)了TLR4+CXCR4+漿細(xì)胞在SLE發(fā)展中的關(guān)鍵作用[7]。本文的研究結(jié)果與上述研究相一致,我們發(fā)現(xiàn)不僅TLR4、CXCR4在天皰瘡患者皮損部位表達(dá)水平顯著增高,而且TLR4和CXCR4在天皰瘡患者外周血單核細(xì)胞中數(shù)量顯著增多。既往研究表明,TLR4-/-小鼠表現(xiàn)出Th1、IFNγ和Th17相關(guān)IL-17A和IL-6細(xì)胞因子產(chǎn)生的顯著減少,抗dsDNA和抗RNP自身抗體水平均顯著降低。TLR4-/-小鼠腎損傷減輕,腎小球免疫球蛋白和補(bǔ)體沉積減少[27];相反,TLR4過表達(dá)導(dǎo)致自身免疫性腎小球腎炎[15];同樣地,在SLE中,CXCR4/CXCL12軸在致病PC遷移到炎癥器官(如腎臟)中起著重要作用[23]。

眾所周知,不同的自身免疫性疾病的病理機(jī)制存在較大區(qū)別。但天皰瘡患者和類天皰瘡患者皮損部位TLR4表達(dá)顯著增加[7];表達(dá)增加后的TLR4可以上調(diào)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子[13]。在類天皰瘡中,CXCL12可趨化表達(dá)CXCR4的T淋巴細(xì)胞,引起T淋巴細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致皰液形成[26],CXCL12/CXCR4軸通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc而導(dǎo)致B細(xì)胞分化和自身抗體的產(chǎn)生[1]。由此推之,TLR4和CXCR4可能在天皰瘡中驅(qū)動B細(xì)胞的趨化和分化,從而促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生,在天皰瘡發(fā)病機(jī)制中起重要作用。