鄧覓，鐘華，夏嵩，吳永明*，李榮富，金丹鳳，梁培瑜

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330096；2.武漢大學(xué)水利水電學(xué)院，武漢 430072；3.江西省科學(xué)院能源研究所，南昌 330096）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）蔓延對我國養(yǎng)豬行業(yè)產(chǎn)生巨大沖擊，消毒作為一種可有效切斷病原微生物傳播途徑和控制傳染病的重要防疫手段，導(dǎo)致消毒劑用量激增，進(jìn)而造成大量消毒劑殘留于豬場糞尿并隨糞尿一同流入后端廢水處理系統(tǒng)，從而對以“微生物作用”為主體的廢水處理系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致出水水質(zhì)變差[1-2]。

當(dāng)前豬場常用的消毒劑主要包括堿類、醛類、鹵素類、酚類和氧化劑等，其主要是通過使微生物的蛋白質(zhì)、酶、核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生致死性改變，使酶系統(tǒng)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，從而抑制細(xì)胞代謝機(jī)能[1]。近些年，練植嬋等[3]、吳園園[4]和張京景等[5]報道了多種殘留消毒劑對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的影響，并指出過量消毒劑會抑制CH4產(chǎn)生且會降低COD、NH3-N 等污染物去除效果，但這些研究均未從微生物層面對這些現(xiàn)象進(jìn)行分析?；诋?dāng)前畜禽養(yǎng)殖糞污處理，關(guān)于微生物多樣性的研究多集中于重金屬和抗生素等方面[6-8]，而有關(guān)高劑量殘留消毒劑對厭氧發(fā)酵過程中微生物多樣性變化的影響研究甚少。在非洲豬瘟尚未得到遏制的情況下，可以預(yù)見今后消毒劑在各類環(huán)境介質(zhì)中將普遍存在且濃度將逐年增加，因此，本文選擇一款殺菌效果明顯的國際知名、且使用廣泛的商品消毒劑——衛(wèi)可（VirkonTM，主要成分是過硫酸氫鉀）作為研究對象[9]，從CH4產(chǎn)量[10]、COD 等理化指標(biāo)[11]和微生物群落的結(jié)構(gòu)及組成[12]等角度出發(fā)，探討上述多尺度效應(yīng)與微生物響應(yīng)的關(guān)系，評估豬場常用消毒劑大量使用對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)造成損傷的程度，揭示消毒劑對厭氧菌群間的相互作用關(guān)系，以期為指導(dǎo)豬場疫（病）情期間消毒劑的合理使用提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

厭氧消化污泥取自未受消毒劑影響的南昌某規(guī)模化養(yǎng)豬場厭氧發(fā)酵罐高活性污泥；新鮮豬糞取自南昌某規(guī)?；i場育肥豬正常排泄物，未接觸消毒劑。

1.2 試驗設(shè)置

消毒劑濃度：基于聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）公布的《非洲豬瘟——發(fā)現(xiàn)與診斷（中文版）》、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2021 年5 月6 日發(fā)布的《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實施方案（第五版）》以及衛(wèi)可生產(chǎn)廠家推薦的1∶200 兌水使用濃度[9，13-14]，并結(jié)合消毒劑使用后經(jīng)豬舍沖洗水稀釋及環(huán)境滯留、降解等影響，最終選定衛(wèi)可質(zhì)量濃度分別為0.05%和0.5%，以探究其對厭氧消化系統(tǒng)的影響。每組試驗設(shè)3個重復(fù)。

試驗組設(shè)置：空白組為超純水中添加接種污泥，以評價接種污泥的生物活性，記為Blank 組；對照組為新鮮豬糞添加接種污泥，記為CK組；試驗組為新鮮豬糞添加接種污泥后分別添加質(zhì)量濃度為0.05%和0.5%的衛(wèi)可，記為L組和H組。

反應(yīng)條件設(shè)置：采取一次性投料的厭氧濕式發(fā)酵方式，選擇衛(wèi)可消毒劑，在XT5018GP 型全自動甲烷潛力測試系統(tǒng)（AMPTS Ⅱ，瑞典Bioprocess Control 公司，見圖1）中開展試驗[15]。接種污泥（馴化的厭氧污泥，VSS含量0.015 2 g·mL-1）和物料（不含消毒劑的新鮮豬糞，VSS 含量0.209 1 g·g-1，濕質(zhì)量）按揮發(fā)性固體（VSS）比2∶1 進(jìn)行混合[16]，通過添加一定量的超純水以保證總固體（TS）濃度為2%，并將400 g上述混合物加入到500 mL 玻璃反應(yīng)瓶（厭氧消化單元）中，于中溫（37±0.5）℃水浴加熱，通過電機(jī)自動控制攪拌循環(huán)（5 min 攪拌，5 min 停止），直至當(dāng)天產(chǎn)氣量不足累計產(chǎn)氣量1%，視為試驗結(jié)束[15]。接種時，在玻璃反應(yīng)瓶內(nèi)接入500 mL·min-1氮?dú)饬?，保? min 左右，保證整個反應(yīng)體系處于嚴(yán)格的厭氧環(huán)境。

1.3 樣品的采集與分析

CH4的收集：AMPTS Ⅱ裝置（圖1）配備有可控溫的發(fā)酵單元，內(nèi)含NaOH溶液+石蕊指示劑的CO2吸收瓶（圖1a），15組分辨率為10 mL的微量氣體流量計組陣（圖1b），可實現(xiàn)整個厭氧發(fā)酵周期連續(xù)全自動批量采集CH4，并通過內(nèi)置的溫度及壓力傳感器自動校正數(shù)據(jù)，獲取精確的氣體流量等數(shù)據(jù)[16]。

圖1 全自動甲烷潛力測試系統(tǒng)（AMPTS Ⅱ）Figure 1 Automatic methane potential test system Ⅱ

理化指標(biāo)及污泥樣本收集：在啟動期（第0 天）和結(jié)束期（第12 天）測定pH，并從各玻璃反應(yīng)瓶（厭氧發(fā)酵單元）中取15 mL搖勻后的泥水混合樣本，在4 ℃下，于離心機(jī)中以3 000g離心分離5 min，取底泥0.5～1.0 g 保存于無菌離心管中，離心管先放入液氮中，后于-80 ℃保存，用于微生物多樣性分析；上清液用于測試COD、NH3-N、TN 和TP 等理化指標(biāo)，對應(yīng)測定方法依次參照《HJ 828—2017》《HJ 535—2009》《HJ 636—2012》和《GB 11893—1989》。

微生物多樣性分析：按照Xu 等[17]和Benay 等[18]報道的方法，采用E.Z.N.A.?土壤DNA 提取試劑盒（Omega，美國）對樣品微生物群落總DNA 進(jìn)行提取，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量，并通過NanoDrop2000測定DNA的濃度和純度；待檢驗合格后，以338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′）為引物，對16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 建庫，利用Illumina公司的MiSeq PE300 平臺測序，以分析厭氧活性污泥中微生物多樣性的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Origin 8.5 和GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著；微生物多樣性數(shù)據(jù)處理借助上海美吉生物云平臺完成[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對厭氧消化產(chǎn)甲烷特征的影響

由圖2a和圖2b可知，空白組持續(xù)產(chǎn)氣12 d，累計產(chǎn)氣量達(dá)（85.10±3.99）mL，表明接種污泥具有較高的活性[13]。CK 組初始階段快速產(chǎn)氣，無明顯遲滯期。與CK 組相比，試驗組顯示厭氧消化系統(tǒng)中衛(wèi)可的存在會影響CH4的產(chǎn)生，且表現(xiàn)出明顯的劑量關(guān)系。由圖2b 可知：CH4產(chǎn)生量在L 組和H 組受到抑制，產(chǎn)量分別比CK 組降低了7.53%（P＞0.05）和92.60%（P＜0.001）；對于產(chǎn)氣周期，L 組和H 組分別為12 d 和1 d，較CK組（10 d）分別延長20%和縮短90%。由圖2a可知，CK 組、L 組和H 組的產(chǎn)氣高峰時間分別出現(xiàn)在第3天、第3天和第1天，其最高日產(chǎn)CH4量分別為（128.15±0.35）、（102.93±8.11）、（39.07±1.07）mL·d-1，單位質(zhì)量可揮發(fā)性有機(jī)物（豬糞的VSS）對應(yīng)的最大產(chǎn)CH4速率依次為（23.54±0.06）、（18.90±1.49）、（7.73±0.01）mL·g-1·d-1，相應(yīng)地，消化結(jié)束后總產(chǎn)CH4量分別為（104.51±1.93）、（96.64±7.80）、（7.73±0.01）mL·g-1。

如圖2c所示，通過對反應(yīng)時間和CH4產(chǎn)率的數(shù)據(jù)擬合發(fā)現(xiàn)，除H 組外（產(chǎn)CH4僅1 d）的整個厭氧消化產(chǎn)氣過程滿足準(zhǔn)一級動力學(xué)方程[20]，并具體表現(xiàn)為：Blank 組、CK 組和L 組的準(zhǔn)一級動力學(xué)擬合方程分別為G（t）=15.387 55（1-e-0.47078t）、G（t）=114.131 23（1-e-0.26678t）和G（t）=108.935 23（1-e-0.2246t），相關(guān)系數(shù)（R2）依次為0.990 0、0.980 7 和0.980 0，對應(yīng)的理論CH4產(chǎn)率（G∞）分別為15.39、114.13 mL·g-1和108.94 mL·g-1，與實測的（15.63±0.73）、（104.51±1.93）mL·g-1和（96.64±7.80）mL·g-1相近；同時，產(chǎn)CH4速率常數(shù)也因消毒劑的添加受到抑制，由CK組的0.267 d-1下降到L組的0.225 d-1。由此可見，衛(wèi)可會抑制厭氧消化產(chǎn)CH4的性能，并表現(xiàn)出明顯的劑量關(guān)系。

圖2 衛(wèi)可對厭氧消化產(chǎn)甲烷特征的影響Figure 2 Effect of VirkonTM on the characteristics of methane production from anaerobic digestion

2.2 消毒劑對厭氧消化過程中理化性質(zhì)的影響

由圖3可知，無論是剛加入消毒劑的啟動期（第0天），還是反應(yīng)的結(jié)束期（第12 天），衛(wèi)可對厭氧消化液中的COD、TP、NH3-N、TN 和pH 值5 個理化指標(biāo)均有顯著影響，且其作用是快速、持久的。具體表現(xiàn)為：相較于CK 組，H 組對反應(yīng)體系中的5 個理化指標(biāo)均表現(xiàn)出極顯著影響（P＜0.01 或P＜0.001），L 組則僅對pH值造成顯著性下降。COD 表現(xiàn)出與衛(wèi)可劑量呈正相關(guān)，在第0 天，L 組和H 組比CK 組[（669.50±4.33）mg·L-1]分別高出16.48%和148.77%（P＜0.001），而第12 天反應(yīng)結(jié)束時，L 組和H 組比CK 組[（506.50±2.50）mg·L-1）]分別高出11.91%和368.97%（P＜0.001），由圖3a可見，經(jīng)過厭氧消化反應(yīng)后，CK組和L組的COD均呈現(xiàn)正常的下降現(xiàn)象，而H 組的COD 反而大幅升高；對于TP，在第0 天和第12 天時L 組中TP 濃度的提升效果不顯著，但H 組中TP 濃度分別高達(dá)（151.99±7.34）mg·L-1和（293.25±4.61）mg·L-1，比CK組分別高出214.11%（P＜0.001）和498.12%（P＜0.001），表明衛(wèi)可在厭氧環(huán)境下也會促進(jìn)磷的釋放；NH3-N 和TN 整體呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，濃度逐漸上升，但相較于CK 組，L 組的NH3-N 和TN 釋放效應(yīng)不顯著，H 組則呈現(xiàn)顯著性增加，在第0 天，H組NH3-N 和TN 濃度分別為（203.47±4.31）mg·L-1和（350.02±6.61）mg·L-1，比CK組高出64.79%（P＜0.001）和68.77%（P＜0.001），到第12 天時，對應(yīng)的NH3-N 和TN 濃度分別達(dá)到（302.27±2.80）mg·L-1和（426.88±8.21）mg·L-1，比CK 組高出44.37%（P＜0.01）和53.30%（P＜0.001），表明衛(wèi)可在厭氧環(huán)境下會促進(jìn)氮素的釋放；對于pH 值，則表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，衛(wèi)可含量越高，系統(tǒng)pH 值越低，但反應(yīng)前后變化較小，在第0 天和第12 天，H 組的pH 值分別為（5.73±0.04）和（6.08±0.02），較CK 組分別低1.45（P＜0.001）和0.99（P＜0.001）。綜上可知，衛(wèi)可會導(dǎo)致厭氧發(fā)酵液中COD 不降反升，且大幅促進(jìn)TP、NH3-N 和TN 的釋放，同時伴隨pH值的下降。

圖3 厭氧發(fā)酵前后理化性質(zhì)的變化Figure 3 Changes of physicochemical properties during anaerobic fermentation

2.3 微生物多樣性特征分析

2.3.1 微生物群落組成特征

通過對18個樣品進(jìn)行高通量測序，共獲得791 710條高質(zhì)量序列，每個樣品33 313～74 828 條，平均50 874 條。所有樣品共獲得51 個門、98 個綱、212 個目、362個科、699個屬、1 200個種和2 172個OTU。

2.3.2 微生物群落豐度和多樣性分析

對合格序列均一化處理后，選擇Sobs、Simpson、Shannon、Ace 和Chao 等α 多樣性分析指數(shù)，對厭氧發(fā)酵前后微生物群落的豐富度和多樣性進(jìn)行評估，具體見表1。

表1 不同處理組在厭氧發(fā)酵前后細(xì)菌群落多樣性指數(shù)變化（OTU水平）Table 1 Changes of bacterial community diversity index in different treatment groups during anaerobic fermentation（OTU level）

由表1 知，作為反映微生物菌群豐度的Ace 和Chao 指數(shù)，無論是剛加入衛(wèi)可的第0 天，還是反應(yīng)結(jié)束的第12天，L組和H組均比CK組低，且反應(yīng)時間越長其抑制效果越明顯，反應(yīng)結(jié)束時H 組的Ace和Chao指數(shù)分別為（773±21）和（770±25），顯著低于CK 組對應(yīng)的（1 399±115）和（1 254±77）（P＜0.05）。而針對反映微生物菌群多樣性的Shannon 和Simpson 指數(shù)，無論是第0 天還是第12 天，Shannon 指數(shù)均表現(xiàn)為L 組和H 組低于CK 組，Simpson 指數(shù)則與之相反，且表現(xiàn)出與消毒劑之間明顯的劑量關(guān)系，其中高的Shannon指數(shù)和低的Simpson 指數(shù)代表高的菌群多樣性[21]。此外，H 組較CK 組的Shannon 指數(shù)顯著下降（P＜0.05），而Simpson 指數(shù)雖然在3 個試驗組間無顯著差異，但均表現(xiàn)為CK 組＜L 組＜H 組，說明微生物多樣性隨著消毒劑劑量的增加而減少（P＞0.05），這也進(jìn)一步表明微生物多樣性與微生物豐度的結(jié)果相似。

2.3.3 微生物群落組成分析

從門水平和屬水平分析不同試驗組在厭氧發(fā)酵前后微生物群落組成差異，結(jié)果見圖4。由圖4可知，不同試驗組中微生物菌群的組成明顯不同，且厭氧發(fā)酵結(jié)束后對應(yīng)優(yōu)勢菌門也有所改變。

圖4 衛(wèi)可消毒劑添加下發(fā)酵細(xì)菌群落變化Figure 4 Fermentation bacterial community changes under VirkonTM disinfectant additions

在門水平，厭氧發(fā)酵前后均表現(xiàn)出厚壁菌門（Firmicutes）是第一優(yōu)勢菌群，其在啟動期和結(jié)束期時的占比分別為79.72%（CK 組）、88.21%（L 組）、91.77%（H 組）和57.49%（CK 組）、72.14%（L 組）和82.43%（H組），這與黃瀟[22]、閆冰等[23]和朱文博等[24]關(guān)于厚壁菌門是發(fā)酵系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群的結(jié)論一致；其次是變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其他微生物豐度均低于5%。此外，無論是剛加入衛(wèi)可的啟動期，還是厭氧發(fā)酵反應(yīng)的結(jié)束期，厚壁菌門豐度均隨消毒劑劑量的增加而增大，變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門則與之相反，隨衛(wèi)可劑量的增加而減少，其中擬桿菌門在剛開始階段反應(yīng)最為敏感，短時間內(nèi)直接由4.39%（CK 組）降低至0.31%（H 組），但到反應(yīng)結(jié)束時會再次上升至1.81%（H 組）；而綠彎菌門則由3.89%（CK 組）下降至1.83%（H 組），直至反應(yīng)結(jié)束再次降低至0.81%（H 組）。對于其他關(guān)鍵微生物菌群中的互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、熱袍菌門（Thermotogae）和陰溝單胞菌門（Cloacimonetes）在添加衛(wèi)可后變化較為明顯，前者由啟動期的0.42%（H 組）大幅提升至結(jié)束期的4.32%，增幅約10 倍；后兩者在高劑量衛(wèi)可添加下，豐度快速地由未添加消毒劑的0.20%～0.28%（CK 組）降低至0，且直至12 天后的反應(yīng)結(jié)束期，其豐度依然為0，表明熱袍菌門和陰溝單胞菌門會因高劑量衛(wèi)可的添加而消失。

在屬水平，優(yōu)勢菌屬主要包括束毛球菌屬（Trichococcus）、嚴(yán)格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、己酸菌屬（Terrisporobacter）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）等，其豐度占比分別為12.03%～59.16%、9.20%～22.12%、7.18%～13.06%、2.82%～8.36%。在經(jīng)厭氧消化后，部分細(xì)菌群落在屬水平發(fā)生了較大變化，束毛球菌屬由42.15%～59.26% 降至12.02%～30.37%，且厭氧消化反應(yīng)前后均表現(xiàn)出消毒劑試驗組高于CK 組；也有一些菌屬在加入衛(wèi)可后相對豐度顯著降低并在厭氧消化結(jié)束后甚至被殺滅，其中吉斯伯格菌屬（Giesbergeria）和Lentimicrobium屬的豐度就與衛(wèi)可表現(xiàn)出明顯的劑量關(guān)系，H 組較CK 組短時間內(nèi)兩菌屬豐度明顯減少，分別在啟動期由2.309%降至0.003%和由0.105%降至0.002%，且厭氧消化結(jié)束后均被殺滅（相對豐度為0）。此外，也存在部分菌屬豐度顯著增加的現(xiàn)象，如消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）在厭氧消化開始時由0.003%（CK 組）快速增至0.385%（H 組），增幅約128 倍，在厭氧消化結(jié)束后H 組繼續(xù)增至4.007%，增幅約10 倍；埃希氏-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）在厭氧消化開始時由0.070%（CK 組）降至0.002%（H 組），厭氧消化結(jié)束后H 組大幅增至2.542%，增幅達(dá)1 270 倍；Macellibacteroides在厭氧消化開始時由0.013%（CK 組）降至0.001%（H 組），厭氧消化結(jié)束后H 組大幅增至1.445%，增幅達(dá)1 444倍。

2.3.4 微生物與厭氧消化理化指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系

在門水平，選擇豐度前20 的菌群，分析其與厭氧消化理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，結(jié)果見圖5。除了厚壁菌門和梭桿菌門（Fusobacteria）與COD 和TP 降解呈極顯著正相關(guān)外，其余大部分菌門（綠彎菌門、陰溝單胞菌門等）都與COD 和TP 降解呈顯著負(fù)相關(guān)[25]。通過結(jié)合圖4指出陰溝單胞菌門在添加衛(wèi)可后其相對豐度增幅約10倍的現(xiàn)象也進(jìn)一步佐證了TP異常上升的原因。而在NH3-N 和TN 的轉(zhuǎn)化和降解方面，變形菌門、互養(yǎng)菌門、Epsilonbacteraeota 門、梭桿菌門等與之呈正相關(guān)，綠彎菌門與TN降解呈顯著負(fù)相關(guān)，其余菌門均不能顯著影響NH3-N和TN。

圖5 主要微生物菌群與關(guān)鍵理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis between main microbial flora and key physicochemical indexes

3 討論

通過圍繞不同劑量衛(wèi)可對豬場糞污厭氧消化影響的研究發(fā)現(xiàn)：CK組初始階段會快速產(chǎn)氣，無明顯的遲滯期，表明接種物具有較高的活性且對豬糞和厭氧環(huán)境條件具有良好的適應(yīng)性；雖然接種物經(jīng)過良好的馴化，具有了較高的生物活性，但厭氧消化系統(tǒng)中衛(wèi)可的存在仍會影響CH4的產(chǎn)生，且表現(xiàn)出明顯的劑量關(guān)系，結(jié)合圖2可知，相較CK組，L組和H組會抑制產(chǎn)CH4，且H 組表現(xiàn)出顯著差異，而在產(chǎn)氣周期上，H 組相對于CK 組也縮短90%，可見，0.5%衛(wèi)可會明顯抑制產(chǎn)氣量且極大縮短產(chǎn)氣時間。究其原因為過硫酸氫鉀作為衛(wèi)可的主要成分具有強(qiáng)氧化性，這與國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于其他氧化型消毒劑的研究結(jié)果相似，如Eunseok 等[26]指出500、1 500 mg·L-1和3 000 mg·L-1NaClO 使厭氧條件下CH4產(chǎn)率分別下降13%、24%和60%，Yang 等[27]也強(qiáng)調(diào)0.03 g·g-1和0.24 g·g-1過硫酸氫鉀會導(dǎo)致CH4產(chǎn)量下降約33%和89%，同時畢培等[28]也表明過硫酸鉀會通過抑制產(chǎn)甲烷菌活性而使CH4產(chǎn)量下降。此外，結(jié)合CH4產(chǎn)率（圖2）與COD、TP、NH3-N、TN、pH 等常規(guī)理化指標(biāo)（圖3）的變化發(fā)現(xiàn)，在剛加衛(wèi)可的第0天，對于COD，L組和H 組較CK組分別高出16.48%和148.77%，對于TP，分別高出214.11%和498.12%；H 組NH3-N 和TN 濃度分別較CK組高出64.79%和68.77%，同時L組和H組的pH分別較CK組下降1.45（P＜0.001）和0.99（P＜0.001），據(jù)此推測衛(wèi)可的添加很有可能會導(dǎo)致厭氧消化系統(tǒng)發(fā)生快速的水解酸化，使之發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)物濃度高于微生物自身的代謝利用能力，從而導(dǎo)致酸化產(chǎn)物積累，而COD、氮、磷的異常升高則很有可能是由衛(wèi)可的主要成分過硫酸氫鉀對微生物細(xì)胞的破壞和溶解所造成[26]；直至整個厭氧消化反應(yīng)結(jié)束期（第12 天），COD不降反升，且大幅促進(jìn)TP、NH3-N 和TN 釋放的異?，F(xiàn)象不僅沒有恢復(fù)，反而加劇惡化，說明其反應(yīng)體系中的厭氧微生物活性可能受到衛(wèi)可的明顯抑制甚至失活，而Peter等[29]和王旭東等[30]關(guān)于NaClO 和檸檬酸消毒劑對微生物的影響機(jī)制可以較好地證明該推測。由此進(jìn)一步表明，衛(wèi)可對豬場糞污發(fā)酵系統(tǒng)的抑制作用是快速且持久的，其中pH 值降低除了受過硫酸氫鉀自身顯酸性影響外，更與揮發(fā)性脂肪酸的積累密切相關(guān)[31]。

此外，通過分析發(fā)酵過程中微生物群落功能多樣性，可科學(xué)評估微生物群落狀態(tài)與功能變化，進(jìn)而揭示微生物的生態(tài)特征及影響發(fā)酵效能的生物因素[10，32]。由表1可知，在不同階段的厭氧發(fā)酵期，衛(wèi)可均表現(xiàn)出對厭氧系統(tǒng)中微生物多樣性的不利影響，在啟動期，呈現(xiàn)出抑制微生物多樣性（Shannon 和Simpson指數(shù)）和物種豐度（Ace和Chao指數(shù)），且H 組具有顯著抑制性（P＜0.05）；隨著發(fā)酵時間延長，就Shannon指數(shù)而言，L 組由啟動期的（2.802±0.165）增加至結(jié)束期的（3.513±0.145），相應(yīng)地H 組由（2.26±0.08）增至（3.19±0.27），由此表明，試驗結(jié)束期較啟動期增加了微生物菌群多樣性和物種豐度。其原因可能在于厭氧發(fā)酵初期，衛(wèi)可對微生物生長有抑制作用，導(dǎo)致微生物群落多樣性降低，隨著發(fā)酵時間的延長，衛(wèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有顯著優(yōu)勢度的抗藥性菌群，使得微生物菌群多樣性和物種豐度增高[27，31]。同時結(jié)合圖2a 亦可進(jìn)一步證明，L 組在添加衛(wèi)可的前4 d，其產(chǎn)氣率均低于CK 組，但第5 天后衛(wèi)可對微生物的抑制作用減弱，進(jìn)而出現(xiàn)了其產(chǎn)率與CK組接近的現(xiàn)象。

結(jié)合圖4 分析可知，在厭氧消化反應(yīng)前后，添加衛(wèi)可的試驗組均表現(xiàn)出厚壁菌門相對豐度隨著反應(yīng)時間延長而降低，而變形菌門相對豐度則與之相反。其原因可能是由于厭氧過程使系統(tǒng)有機(jī)物濃度降低，使得可供厚壁菌門吸收利用的物質(zhì)減少，從而導(dǎo)致其豐度減小[33]；對于變形菌門，正如Hyun 等[34]研究指出其可能是一類兼性或?qū)Ｐ詤捬跫?xì)菌或寡營養(yǎng)菌，其在厭氧環(huán)境或有機(jī)物質(zhì)濃度較少的環(huán)境下更易存活。對于這兩類優(yōu)勢菌門，添加衛(wèi)可后，無論是啟動期，還是結(jié)束期，厚壁菌門豐度均隨消毒劑劑量增加而增大，變形菌門豐度大體呈現(xiàn)隨衛(wèi)可劑量增加而減小，這表明添加衛(wèi)可會促進(jìn)原料（豬糞）或者污泥（微生物）的水解或者裂解，導(dǎo)致厭氧系統(tǒng)中可利用的有機(jī)物濃度增高，而結(jié)合COD 等理化指標(biāo)不降反升（圖3）和厚壁菌門與COD 降解呈極顯著正相關(guān)（圖5）的現(xiàn)象也可進(jìn)一步佐證這一可能性[2，26，35]。

4 結(jié)論

（1）衛(wèi)可消毒劑在豬場糞污厭氧消化系統(tǒng)中的質(zhì)量濃度為0.05%和0.5%時，均會導(dǎo)致豬糞污厭氧消化系統(tǒng)的功能不同程度受損，并表現(xiàn)為：抑制厭氧產(chǎn)CH4效能，對COD、TP、NH3-N、TN 和pH 值5 個理化指標(biāo)具有顯著性影響（P＜0.01），并伴隨COD 不降反升、大幅促進(jìn)氮磷釋放等異?，F(xiàn)象，且該作用是快速、持久的。

（2）高通量測序發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)可會導(dǎo)致厭氧系統(tǒng)中細(xì)菌群落組成、多樣性和豐度發(fā)生顯著性變化，其中，Shannon 指數(shù)均表現(xiàn)為L 組和H 組低于CK 組（P＜0.05），Simpson 指數(shù)則與之相反，表現(xiàn)為CK＜L＜H（P＞0.05）；優(yōu)勢菌門中的厚壁菌門豐度隨衛(wèi)可劑量增加而增大，變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門則與之相反；另外，陰溝單胞菌門會因0.5%衛(wèi)可而消失。

（3）在豐度前20 的菌門中，厚壁菌門和梭桿菌門與COD 降解呈極顯著正相關(guān)，變形菌門、Epsilonbacteraeota、互養(yǎng)菌門、梭桿菌門等與NH3-N 和TN 降解呈正相關(guān)，同時綠彎菌門與TN降解呈顯著負(fù)相關(guān)。