張 健，吳珍芳，楊化強(qiáng)

(嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室云浮分中心/廣東中芯種業(yè)科技有限公司,廣東 云浮 527400)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“豬藍(lán)耳病”，是導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)重大損失的主要疾病之一；其防控較為困難與該病病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的遺傳多樣性有關(guān)。PRRSV是約15 kb的單鏈RNA病毒，有2種特征明確的基因型：Ⅰ型，又稱為歐洲型(EU型)；Ⅱ型，也稱為北美型(NA型)。我國流行的PRRSV毒株絕大部分為NA型。2006年中國第1次爆發(fā)高致病性豬藍(lán)耳病疫情，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[1-2]。2013年，中國首次發(fā)現(xiàn)新的重組PRRSV毒株，稱為類NADC30(NADC30-like)，該毒株引起的呼吸道癥狀不明顯，死亡率低，但卻會對母豬繁殖性能造成嚴(yán)重影響，母豬流產(chǎn)率高達(dá)30%[3-4]。近幾年流行病學(xué)調(diào)查表明NADC30-like毒株已成為優(yōu)勢流行毒株，特別是在華南地區(qū)呈擴(kuò)散態(tài)勢，對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)[5]。過去，疫苗接種一直是預(yù)防PRRSV感染的主要策略。針對PRRSV的多種改良活疫苗和滅活疫苗已經(jīng)開發(fā)出來，然而由于PPRSV的高度重組和變異，這些疫苗未能提供可持續(xù)的保護(hù)[6-8]，豬場藍(lán)耳病仍時(shí)有出現(xiàn)，因此急需一種行之有效的方法來抵抗PRRSV在豬場的傳播。

利用CR ISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除PRRSV關(guān)鍵宿主因子是一個(gè)很有前景的方法。想要通過基因編輯技術(shù)制備出能夠抵抗某一種病毒的豬，重要的前提條件是，需要知道該病毒與宿主互作的關(guān)鍵受體基因。目前只有為數(shù)不多的幾種病毒受體得到了鑒定[9-11]，CD163基因是目前最廣為認(rèn)知的病毒受體，Whitworth等[12]在2015年證實(shí)CD163基因敲除(CD163 gene knockout，CD163-KO)大白豬表現(xiàn)出顯著的PRRSV耐藥性，并且CD163基因修飾豬沒有出現(xiàn)病毒血癥和臨床癥狀。2018年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳珍芳教授課題組利用類似試驗(yàn)驗(yàn)證了CD163-KO杜洛克豬可以完全抵抗高致病性PRRSV的感染[13]。近年來國內(nèi)外大量研究也證明CD163是PRRSV感染宿主細(xì)胞必不可少的蛋白分子，敲除CD163基因可使豬抵抗PRRSV的感染[14-20]。

本研究是在團(tuán)隊(duì)前期研究的基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和體細(xì)胞核移植的方法，成功獲得CD163-KO大白豬。接種國內(nèi)目前流行的NADC30-like毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，通過臨床觀察、免疫熒光試驗(yàn)、檢測血清中抗體滴度和病毒RNA水平等方法，證明了所獲得的CD163-KO大白豬能夠完全抵抗NADC30-like毒株的感染；同時(shí)，為了評估基因修飾對種豬生產(chǎn)和繁殖性能的影響，我們對CD163-KO大白豬的生長速度、繁殖性能、肉料比等生產(chǎn)性能進(jìn)行了分析，評估其生產(chǎn)性能和育種價(jià)值，為其可能的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大白豬胎兒成纖維細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳珍芳教授課題組分離培養(yǎng)并保存，代孕母豬由廣東中芯種業(yè)科技有限公司提供。豬藍(lán)耳病NADC30-like毒株為溫氏食品集團(tuán)股份有限公司研究院豬病研究室惠贈。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬CD 163基因gRNA設(shè)計(jì)及靶向質(zhì)粒pX330-CD163的構(gòu)建 針對豬CD163基因外顯子7 (Exon 7)設(shè)計(jì)gRNA：選擇GGTCGTGTTGAAGTAC AACA為打靶位點(diǎn)，TGG為引導(dǎo)識別位點(diǎn)(圖1)。表達(dá)gRNA的DNA序列在兩端帶上的酶切位點(diǎn)為Bbs I，生物合成gRNA互補(bǔ)雙鏈?正義鏈：5′-CACCGGTCGTGTTGAAGTACAACA-3′，反義鏈：5′-AAACTGTTGTACTTCAACACGACC-3′，退火后連接到載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBhhSpCas9(簡稱PX330，Addgene，貨號42230)，構(gòu)成靶向質(zhì)粒pX330-CD163。

圖1 豬CD163基因示意圖和CD163-gRNA序列Fig.1 Genetic map of pig CD163 gene and sequence of CD163-gRNA

1.2.2 陽性單克隆細(xì)胞的篩選與體細(xì)胞核移植

復(fù)蘇大白豬胎兒成纖維細(xì)胞，用含15%(φ)胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于38℃、5%(φ)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至80%匯合度時(shí)消化備用，按照Lonza原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將10μg靶向質(zhì)粒pX 330-CD163轉(zhuǎn)染至1×106個(gè)豬胎兒成纖維細(xì)胞中，使用A-033程序進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞按照每cm210個(gè)細(xì)胞的密度接種到直徑10 cm的培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng)10 d，中途換液1次。10 d后挑取單克隆至48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，48孔長滿后取少許細(xì)胞直接裂解并進(jìn)行PCR檢測，篩選CD163陽性細(xì)胞，剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。PCR引物為CD163-F：GAATTGTCT CCAGGGAAGGA，CD163-R：AGCCCAGATCTGTCC ACTTC；產(chǎn)物長度：380 bp。陽性細(xì)胞長滿后即可作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植操作，每頭受體母豬移植200～250個(gè)操作胚胎。

1.2.3 CD163-KO大白豬鑒定新生克隆豬采耳組織再進(jìn)行PCR測序鑒定。死亡仔豬采肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓組織，提取總蛋白，進(jìn)行CD163蛋白的Western blot檢測，一抗選用anti-CD163抗體(兔多克隆抗體，ab87099)，100倍稀釋，二抗選用HRP羊抗兔IgG(博士德，BA1054)，內(nèi)參一抗選用GAPDH小鼠單抗(上?？党?，KC-5G4)，二抗用HRP羊抗小鼠IgG(博士德，BA1050)。另取一頭瘦弱仔豬，在實(shí)驗(yàn)室取肺沖出肺泡巨噬細(xì)胞，用鼠抗豬CD163 RPE(伯樂，MCA 2311PE)免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察到CD163-KO大白豬無CD163蛋白表達(dá)。

1.2.4 CD163-KO大白豬攻毒試驗(yàn)取30日齡的11頭CD 163-KO大白豬和5頭野生型大白豬(對照)，用NADC30-like毒株進(jìn)行攻毒，毒價(jià)為1×107TCID50/m L，采用滴鼻1m L和肌注1m L的攻毒方式，攻毒當(dāng)天測量溫度，采集血清，連續(xù)14 d記錄體溫，攻毒后第3、7、10和14天采集血清，檢測血清中PRRSV含量和抗體水平。14 d后殺豬取肺臟組織進(jìn)行免疫熒光檢測。

1.2.5 CD163-KO大白豬單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞對血紅蛋白?結(jié)合珠蛋白復(fù)合物的攝取試驗(yàn)分別取CD163-KO大白豬與野生型大白豬抗凝外周血10m L，根據(jù)TBD動物外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒方法分離外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將分離到的細(xì)胞沉淀用含20%(φ)胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106～10×106/m L，以每孔2m L加入6孔板培養(yǎng)2 h，待PBMC貼壁，用37℃培養(yǎng)基輕輕洗滌3遍，去除懸浮細(xì)胞。換上含10%(φ)胎牛血清和hM-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子，20 ng/m L)的1640誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，中間換液1次，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞。

按照FITC蛋白偶聯(lián)試劑盒(生工，貨號：D601049)標(biāo)記血紅蛋白，再將血紅蛋白?FITC與結(jié)合珠蛋白按照1∶1的質(zhì)量比混合，形成FITC熒光標(biāo)記的血紅蛋白?結(jié)合珠蛋白復(fù)合物，將復(fù)合物按照終質(zhì)量濃度10 μg/m L加入到誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃條件下避光孵育30min，PBS溶液洗2遍后拍照，觀察細(xì)胞熒光情況。

1.2.6 CD163-KO大白豬生產(chǎn)性能和公豬的繁殖性能測定統(tǒng)計(jì)CD163-KO大白豬和野生型大白豬的出生質(zhì)量、終測數(shù)據(jù)及公豬的精液質(zhì)量等指標(biāo)，分析CD163基因敲除是否影響大白豬的生產(chǎn)性能和公豬的繁殖性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD163-KO大白豬的克隆與鑒定

篩選得到3個(gè)陽性單克隆細(xì)胞，移植5頭受體母豬，共分娩18頭克隆仔豬，采集耳組織提取基因組DNA，經(jīng)PCR和測序鑒定，18頭克隆仔豬的CD163基因都是插入1個(gè)A堿基(表1)。采集CD163-KO克隆豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓，Western blot檢測結(jié)果表明成功獲得CD163-KO大白豬(圖2)，CD163-KO大白豬的肺泡巨噬細(xì)胞CD163免疫熒光結(jié)果也證實(shí)CD163蛋白完全缺失(圖3)。

圖2 野生型和CD163-KO大白豬取樣組織中CD163蛋白表達(dá)Fig.2 CD163 protein expression in sampling tissues of wild type and CD163-KO Large White pigs

圖3 野生型和CD 163-KO大白豬肺泡巨噬細(xì)胞表面CD163免疫熒光檢測Fig.3 Immunofluorescence detection of CD163 on the surface of pulmonary alveolar macrophages in wild type and CD163-KO Large White pigs

表1 陽性單克隆細(xì)胞及CD163-KO大白豬測序結(jié)果Table 1 Sequencing results of positive monoclonal cells and CD163-KO Large White pigs

2.2 CD163-KO大白豬攻毒試驗(yàn)

野生型大白豬于攻毒后第3天開始發(fā)熱，直到第14天體溫維持在40℃左右，沒有出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，沒有死亡；CD163-KO大白豬沒有任何臨床癥狀，體溫正常(圖4A)。檢測攻毒CD 163-KO豬第0、3、7、10和14天血清中PRRSV病毒和抗體含量，發(fā)現(xiàn)5頭野生型大白豬病毒核酸水平快速增長，第3天病毒核酸含量達(dá)到81g RNA拷貝數(shù)/m L，而11頭CD163-KO大白豬在此期間血清中病毒含量一直為0(圖4B)。野生型大白豬的抗體水平在第10和14天時(shí)，滴度明顯提高，而11頭CD163-KO大白豬抗體一直是陰性(圖4C)。豬肺臟組織免疫熒光結(jié)果顯示，野生型大白豬肺臟巨噬細(xì)胞表面存在大量的PRRSV，而CD163-KO大白豬完全沒有該病毒存在(圖5)。

圖4 野生型和CD163-KO大白豬攻毒后直腸溫度、血清中PRRSV含量和抗體水平Fig.4 Rectal pemperature,PRRSV load and antibody level in serum of wild type and CD163-KO Large White pigs post infection

圖5 野生型和CD163-KO大白豬攻毒后第14天肺臟PRRSV免疫熒光結(jié)果Fig.5 Immunofluorescence result of PRRSV in lung of wild type and CD163-KO Large White pigs at 14 d post infection

2.3 CD163-KO大白豬巨噬細(xì)胞功能分析

野生型和CD163-KO大白豬得到相同結(jié)果，體外分離得到的單核細(xì)胞利用hM-CSF體外誘導(dǎo)得到的巨噬細(xì)胞能夠正常攝取血紅蛋白?結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(圖6)，并不影響其正常的生理功能。

圖6 野生型和CD163-KO大白豬巨噬細(xì)胞對血紅蛋白?結(jié)合珠蛋白復(fù)合物的攝取能力Fig.6 Up take capacity of macrophages from wild type and CD163-KO Large White pigs to hemoglobinhaptoglobin complex

2.4 CD163-KO大白豬生產(chǎn)和繁殖性能測定

取10頭品系相同、年齡和體質(zhì)量相近的野生型大白豬為陰性對照，對5頭F0代CD163-KO公豬的出生體質(zhì)量、體長、體高、115 kg背膘厚和115 kg眼肌面積、30～115 kg測定期平均日增體質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。F0代基因敲除豬的出生體質(zhì)量、體高、體長、115 kg肌內(nèi)脂肪、115 kg背膘厚、115 kg眼肌面積、平均日增體質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化效率等指標(biāo)與野生型對照沒有明顯差異。

表2 野生型(n=10)和CD16-KO(n=5)大白豬生產(chǎn)性能比較1)Table 2 Comparison of the productive performance of wild type and CD163-KO Large White pigs

取10份F0代CD 163-KO大白豬的精液樣本、20份一級野生型大白豬的精液，進(jìn)行精液質(zhì)量分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3顯示。CD163-KO大白豬采精量，精液1∶1稀釋后精子活力、密度與野生型大白豬無明顯差異，其中畸形率略低于野生型大白豬。

表3 野生型(n=20)與CD163-KO(n=10)大白豬精液質(zhì)量比較1)Table 3 Comparison of the quality of the semen from wild type and CD163-KO Large White pigs

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，PRRSV進(jìn)入細(xì)胞是由多種細(xì)胞受體介導(dǎo)的，如唾液粘附素(Sn/CD169)、CD151、硫酸肝素、CD163[21-23]。其中，目前已經(jīng)證明CD163是PRRSV感染過程中的關(guān)鍵受體。CD163被稱為清道夫受體，是一種I型跨膜糖蛋白，在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系(如肺泡巨噬細(xì)胞)和非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞(MAC145)表面表達(dá)。CD163由富含半胱氨酸的9個(gè)清道夫受體結(jié)構(gòu)域(SRCR1～9)組成，其中SRCR2被證明支持紅細(xì)胞的黏附，促進(jìn)紅細(xì)胞成熟，SRCR 3可以清除血漿中的游離血紅蛋白，SRCR5對PRRSV進(jìn)入靶細(xì)胞至關(guān)重要[24-25]。本研究通過設(shè)計(jì)靶向CD163基因的SRCR5區(qū)域(對應(yīng)外顯子7)的gRNA，通過單克隆篩選只有1個(gè)A堿基插入的突變型作為供體細(xì)胞移植，獲得18頭CD163-KO克隆豬，克隆效率處于較高水平，在方法學(xué)上也為制備CD163-KO大白豬提供了一定的參考。

本研究證實(shí)了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得的CD163-KO大白豬對當(dāng)前本地區(qū)流行的藍(lán)耳病NADC30-like毒株具有完全抗性，并且不損傷豬的主要生產(chǎn)性能。CD163基因缺失并沒有影響豬正常生理功能，體外單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞能夠保持吞噬細(xì)胞外血紅蛋白的功能[24,26]，但是CD163基因敲除是否會影響CD163的其他一些功能還需要更多研究進(jìn)行驗(yàn)證。下一步工作需要盡可能詳盡地追蹤C(jī)D163-KO大白豬的生長性能和繁殖性能，擴(kuò)大群體規(guī)模，為后期應(yīng)用提供更多數(shù)據(jù)支撐。

本研究敲除CD163基因沒有改變豬的生產(chǎn)性能等指標(biāo)。CD163-KO大白豬與自然分娩的野生型大白豬在出生體質(zhì)量和料肉比等性狀上無明顯差異，這一結(jié)果和多數(shù)研究結(jié)果相似。研究報(bào)道，克隆豬的出生、3周齡和斷奶體質(zhì)量以及30～110 kg平均日增體質(zhì)量、料肉比、背膘厚等性狀與對照豬均無明顯差異[27-29]。

對于豬常見的其他傳染性疾病，目前還沒發(fā)現(xiàn)很有效的受體基因。一方面是因?yàn)椴《厩忠u宿主基因組很可能是多個(gè)基因協(xié)同作用的結(jié)果，這導(dǎo)致僅修飾單個(gè)基因很難達(dá)到抵抗病毒入侵的目的；其次，目前的分子試驗(yàn)技術(shù)很難一次性精準(zhǔn)找到與病毒相互作用的關(guān)鍵基因，而會識別出大量的候選基因，導(dǎo)致后期驗(yàn)證工作量異常艱巨，進(jìn)展緩慢。2020年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙書紅教授團(tuán)隊(duì)首次利用豬全基因組CRISPR敲除文庫，對抗乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)基因進(jìn)行了篩選，篩選到幾個(gè)顯著影響JEV病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵基因[29]，然而這些基因并不是JEV病毒進(jìn)入細(xì)胞的膜受體，所以并不能阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。此外，即使找到了病毒的關(guān)鍵受體基因，也不能簡單地將其敲除?；蚪M的每個(gè)編碼基因不僅執(zhí)行特定功能，而且參與多個(gè)基因通路，起著不同的作用，如果簡單地敲除，必然會影響宿主某一方面的功能；或者有些基因至關(guān)重要，敲除后會導(dǎo)致胚胎致死等情況。這些都決定了病毒受體的尋找和利用難度非常大，還有更多的工作要做。