黃健玲，楊子敏，王雨欣，李鑫帥，劉翠瑜，陳錦鵬，秦啟偉，楊敏

(海洋生物資源保護(hù)與利用粵港澳高校聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,廣東 廣州 510642)

石斑魚(yú)Epinephelus spp.是亞洲許多國(guó)家最重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，其繁殖速度較快，肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，隨著集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的快速發(fā)展，細(xì)菌性和病毒性傳染病暴發(fā)的頻率急劇增加，對(duì)石斑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。目前已報(bào)道的感染石斑魚(yú)的致病性病毒主要是虹彩病毒和神經(jīng)壞死病毒[1]。

新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)隸屬于虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus，是從養(yǎng)殖石斑魚(yú)體分離得到的一種高致病性病原，由SGIV引起的疾病暴發(fā)多發(fā)生在仔魚(yú)和成年石斑魚(yú)中，患病魚(yú)脾臟腫大，并伴有出血等癥狀，病癥持續(xù)數(shù)周，患病仔魚(yú)死亡率超過(guò)90%，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。魚(yú)類(lèi)病毒性神經(jīng)壞死病是由神經(jīng)壞死病毒引起的一類(lèi)疾病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)流行性傳染病之一，患病魚(yú)苗體表異常著色，食欲不振，間歇螺旋運(yùn)動(dòng)，腦和視網(wǎng)膜有空泡化病[3-4]。而中國(guó)大多數(shù)海洋魚(yú)類(lèi)病毒性神經(jīng)壞死病是由赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)引起的，對(duì)石斑魚(yú)的成魚(yú)以及幼魚(yú)危害很大，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)100%，嚴(yán)重威脅到石斑魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。然而針對(duì)該病毒性疾病，目前還沒(méi)找到有效的防治方法。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)指生物體的基因組DNA序列中單個(gè)核苷酸發(fā)生突變而產(chǎn)生的多態(tài)性現(xiàn)象，其突變形式包括位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等，一般情況下，等位基因的頻率在同物種的群體中不小于1%[5]。SNP作為一種理想的遺傳標(biāo)記，是基因和表型之間的研究載體，它拉近了分子遺傳標(biāo)記與育種的距離，成為研究疾病、生長(zhǎng)和繁殖性能等經(jīng)濟(jì)性狀與相關(guān)候選基因關(guān)聯(lián)性的新工具。隨著SNP檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，其在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中進(jìn)行特定經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)的挖掘及功能驗(yàn)證也越來(lái)越受到研究者們的重視。在水產(chǎn)動(dòng)物抗病SNP分子標(biāo)記研究中，高煥等[6]對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦Penaeus chinensis抗菌肽SNP位點(diǎn)進(jìn)行了篩查，并對(duì)與白斑綜合征病毒抗性的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其SNP位點(diǎn)很少，且在抗感和易感群體中無(wú)明顯偏向分布。Bao等[7]在海灣扇貝Argopecten irradians超氧化物歧化酶家族的3個(gè)基因的啟動(dòng)子和基因組DNA序列區(qū)域均檢測(cè)到SNP位點(diǎn)，其中3個(gè)位于啟動(dòng)子區(qū)域的SNP位點(diǎn)與鰻弧菌Vibrio anguillarum的抗性顯著相關(guān)。Fu等[8]在尖吻鱸Lates calcarifer的LECT2基因中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNP位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)其與瘦大肚皮病的抗性之間存在顯著的相關(guān)性。

PPAR-δ(Peroxisome proliferator-activated receptorsδ)是核受體超家族PPARs中的一員，是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其在多種生理刺激下調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的脂代謝、免疫反應(yīng)等多種生理過(guò)程。其中PPARs的免疫調(diào)節(jié)作用的研究得到了越來(lái)越多的關(guān)注[9-10]。在不同人體組織中，均發(fā)現(xiàn)PPAR-δ對(duì)炎癥反應(yīng)的密切調(diào)控關(guān)系[10]。除了保持穩(wěn)定的炎癥反應(yīng)，PPAR-δ也影響干擾素信號(hào)通路，在哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞中，PPAR-δ抑制干擾素基因以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[9]，而在另外一些免疫細(xì)胞中PPAR-δ則會(huì)增強(qiáng)干擾素信號(hào)的強(qiáng)度，影響細(xì)胞凋亡[10-12]。前期研究也表明，魚(yú)類(lèi)PPARs在抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[13]。

開(kāi)展石斑魚(yú)抗病品系的選育研究是解決石斑魚(yú)病毒性病害的重要途徑之一，開(kāi)發(fā)抗病相關(guān)分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記定向選育石斑魚(yú)抗病品系，可以有效避免選育的盲目性，從而加快選育進(jìn)程。本研究分別針對(duì)石斑魚(yú)虹彩病毒感染群體和神經(jīng)壞死病毒感染群體進(jìn)行PPAR-δ基因組DNA序列的SNP位點(diǎn)篩選，并對(duì)篩選到的SNP位點(diǎn)進(jìn)行抗病毒關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與抗病毒性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)或基因型，為石斑魚(yú)抗病選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斜帶石斑魚(yú)E.coioides，體質(zhì)量40～60 g，體長(zhǎng)10～14 cm，購(gòu)自福建省廈門(mén)市小嶝島水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，在25～30℃的海水循環(huán)系統(tǒng)中馴化并飼養(yǎng)2周，每天以3%的體質(zhì)量作為喂食量，密切監(jiān)測(cè)海水的溶解氧、pH和氨濃度。

攻毒用SGIV和RGNNV分別從發(fā)病石斑魚(yú)中分離獲得，后利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的石斑魚(yú)脾臟細(xì)胞系(Grouper spleen,GS)進(jìn)行病毒的培養(yǎng)與制備，GS細(xì)胞系用含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(Invitrogen)的Leibovitz’s L15培養(yǎng)基放置于28℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)[14]。利用TCID50法對(duì)制備的SGIV和RGNNV進(jìn)行滴度測(cè)定。制備后的病毒于?80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 半致死濃度的測(cè)定

為了獲得感染石斑魚(yú)苗的SGIV和RGNNV的最適濃度，隨機(jī)選取210尾石斑魚(yú)苗進(jìn)行濃度梯度腹腔注射感染試驗(yàn)，2周后統(tǒng)計(jì)每組累計(jì)死亡率，選取可導(dǎo)致50%～80%石斑魚(yú)死亡率的SG IV和RGNNV感染濃度，進(jìn)行抗感與易感群體篩選的正式試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)SG IV的滴度為1×1 07TCID50/m L時(shí)，其感染魚(yú)苗后的死亡率為72%，當(dāng)RGNNV滴度為1×105TCID50/m L時(shí)，其感染魚(yú)苗后的死亡率為65%，因此選擇上述2個(gè)病毒滴度進(jìn)行正式感染試驗(yàn)。

1.3 石斑魚(yú)抗感和易感群體的采集

隨機(jī)選取520尾魚(yú)苗進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)，共分為3組，對(duì)照組40條魚(yú)腹腔注射100μL PBS溶液，SGIV感染組240尾魚(yú)腹腔注射100μL病毒滴度為1×107TCID50/m L的SGIV溶液，RGNNV感染組240尾魚(yú)腹腔注射100 μL病毒滴度為1×105TCID50/m L的RGNNV溶液，感染后每隔6 h觀(guān)察1次魚(yú)苗死亡情況，參考前期研究中評(píng)判抗感和易感樣品的標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，將感染后5 d內(nèi)死亡的個(gè)體作為易感個(gè)體，感染后14 d后還存活的個(gè)體作為抗感個(gè)體，采集易感、抗感個(gè)體的尾鰭樣品，于樣品穩(wěn)定劑(TaKaRa)中，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA提取

基因組DNA提取使用Trelief ?Animal Genomic DNA Kit(TsingKe)試劑盒，具體方法步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，并用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA提取質(zhì)量。

1.5 石斑魚(yú)PPAR-δ基因組DNA序列的克隆與SNP位點(diǎn)篩選

以斜帶石斑魚(yú)鰭條DNA為模板，根據(jù)石斑魚(yú)基因組中的PPAR-δ基因gDNA序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由北京擎科生物有限公司合成，以上述易感和抗感個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[15]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收以后，克隆至pMD19-T載體，抗感組和易感組各送5個(gè)陽(yáng)性克隆樣品至北京擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多重比對(duì)，觀(guān)察測(cè)序結(jié)果峰圖，預(yù)測(cè)SNP位點(diǎn)。同一位點(diǎn)不同堿基出現(xiàn)比例大于30%則認(rèn)定為SNP位點(diǎn)。

表1 PPAR-δ基因組DNA序列擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PPAR-δ genomic DNA sequence amplification

1.6 SNP的基因分型及與SGIV和RGNNV抗性的關(guān)聯(lián)分析

依據(jù)上述方法預(yù)測(cè)的PPAR-δ基因SNP位點(diǎn)，采用SNaPshot法[17]，分別對(duì)SGIV感染組和RGNNV感染組的易感樣品和抗感樣品進(jìn)行SNP分型，其中SGIV易感組、SGIV抗感組、RGNNV易感組和RGNNV抗感組的樣品數(shù)目均為50尾。SNaPshot分型由北京擎科生物有限公司完成。

使用Popgen 32和PIC軟件分析SNP位點(diǎn)的觀(guān)測(cè)雜合度(Observed heterorozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、哈迪?溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，使用Cervus 3.0軟件計(jì)算位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)等。使用Haploview 4.2軟件進(jìn)行各個(gè)SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡和單倍型的分析。使用SPSS17軟件中的χ2檢驗(yàn)對(duì)SNP位點(diǎn)在抗病組和易感組群體中的基因型頻率和單倍型頻率進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斑魚(yú)PPAR-δ基因結(jié)構(gòu)圖以及篩查的SNP位點(diǎn)信息

根據(jù)石斑魚(yú)基因組中的PPAR-δ基因gDNA序列和轉(zhuǎn)錄組中的cDNA序列，以斜帶石斑魚(yú)鰭條DNA為模板，使用4對(duì)引物(表1)對(duì)PPAR-δ基因的內(nèi)含子及外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，繪制PPAR-δ基因結(jié)構(gòu)圖(圖1)。以易感組和抗感組各5個(gè)基因組DNA樣品作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多重比對(duì)分析。在SGIV感染的易感組和抗感組樣品中共篩查到9個(gè)SNP位點(diǎn)，分別將其命名為SNP-S1(g.940T>A)、SNP-S2(g.994C>G)、SNP-S3(g.1644A>C)、SNP-S4(g.2541C>T)、SNP-S5(g.4188A>T)、SNP-S6(g.4479G>A)、SNP-S7(g.4595T>A)、SNP-S8(g.4791T>A)和SNP-S9(g.4852T>A)，所有SNP位點(diǎn)均位于內(nèi)含子中(圖1A)。在RGNNV感染的易感組和抗感組樣品中共篩查到8個(gè)SNP位點(diǎn)，分別將其命名為SNP-N 1(g.32 4G>A)、SNP-N 2(g.883A>G)、SNP-N 3(g.1140A>T)、SNP-N 4(g.1702A>T)、SNP-N 5(g.2510C>T)、SNP-N 6(g.5253G>C)、SNP-N 7(g.5522G>A)和SNP-N8(g.5564T>C)，其中SNP-N1位于外顯子中，屬于同義突變，沒(méi)有改變編碼的氨基酸，其余SNP均位于內(nèi)含子中(圖1B)。

圖1 石斑魚(yú)PPAR-δ基因結(jié)構(gòu)及SNP位點(diǎn)Fig.1 DNA structure of PPAR-δ gene and its SNP loci of grouper

2.2 石斑魚(yú)PPAR-δ基因組SNP的遺傳多態(tài)性分析

采用SnaPshot分型法對(duì)石斑魚(yú)群體進(jìn)行基因分型分析。在SGIV感染組中，100個(gè)送樣樣品中共獲得100個(gè)有效結(jié)果，其中SGIV抗感組50個(gè)，SGIV易感組50個(gè)。使用Popgen32和PIC軟件對(duì)9個(gè)SNP位點(diǎn)在SGIV抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)顯示：在SGIV抗感組中，PIC的范圍為0.136～0.370，SNP-S1屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP位點(diǎn)屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)；在SGIV易感組中，PIC的范圍為0.177～0.375，其中SNP-S1屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP位點(diǎn)屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)(表2)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，在SGIV抗感組中，除SNP-S4、SNP-S5、SNP-S6、SNP-S7、SNP-S8、SNP-S9不符合Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05)，其余SNP均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)；在SGIV易感組中，除SNP-S9不符合Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05)，其余SNP均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 9個(gè)SNP在石斑魚(yú)SGIV抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性信息Table2 Genetic polymorphisms of nine SNPs in SGIV resistant and susceptible grouper groups

采用SnaPshot分型法對(duì)石斑魚(yú)群體進(jìn)行基因分型分析。在RGNNV感染組中，100個(gè)送樣樣品中共獲得97個(gè)有效結(jié)果，其中RGNNV抗感組48個(gè)，RGNNV易感組49個(gè)。使用Popgen32和PIC軟件對(duì)8個(gè)SNP位點(diǎn)在抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)顯示：在RGNNV抗感組中，PIC的范圍為0.136～0.358，SNP-N1和SNP-N2屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)；在RGNNV易感組中，PIC的范圍為0.106～0.317，其中SNP-N1和SNPN2屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，在RGNNV抗感組中，SNP-N1、SNP-N2和SNP-N4處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，其余SNP均不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；在RGNNV易感組中，除SNP-N 3不符合Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05)，其余SNP均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 8個(gè)SNP在石斑魚(yú)RGNNV抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性信息Table 3 Genetic polymorphisms of eight SNPs in RGNNV resistant and susceptible grouper groups

2.3 石斑魚(yú)PPAR-δ基因組SNP的連鎖不平衡分析及與病毒抗性的關(guān)聯(lián)分析

PPAR-δ基因在SG IV抗感組和易感組的SNP統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表4)顯示：SNP-S7基因型頻率在抗感組和易感組中存在顯著差異分布(P<0.05)；SNP-S7的TT基因型在抗感組中分布頻率為60%，易感組中分布頻率為40%，AT基因型在抗感組中分布頻率為24%，易感組中分布頻率為52%，而AA基因型在抗感組中分布頻率為16%，在易感組中分布頻率為8%，表明TT和AA這2種純合子基因型與SGIV抗感性狀相關(guān)，而AT雜合子基因型與SGIV易感性相關(guān)。

表4 石斑魚(yú)PPAR-δ基因在2種病毒抗感組和易感組的SNP統(tǒng)計(jì)分析Table 4 PPAR-δ gene SNPs analysis in resistant and susceptible grouper groups infected by two viruses

使用Haploview 4.2軟件中的Four Gamete Rule計(jì)算方法對(duì)9個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示：SNP-S4、SNP-S5和SNP-S6這3個(gè)位點(diǎn)高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TTT、AAA、TAA和TAT共4個(gè)單倍型；SNP-S7、SNP-S8和SNP-S9這3個(gè)SNP位點(diǎn)高度連鎖，構(gòu)成單倍塊2，可形成CAG、TTA和CAA共3個(gè)單倍型(圖2)。將上述單倍型與石斑魚(yú)抗虹彩病毒抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示上述單倍型與石斑魚(yú)抗虹彩病毒抗性性狀均無(wú)顯著的相關(guān)性(P>0.05)(表5)。

圖2 石斑魚(yú)SGIV和RGNNV感染組中篩選出PPAR-δ基因SNP標(biāo)記的連鎖不平衡分析Fig.2 Linkage disequilibrium analysis of PPAR-δSNP markers screened from SGIV and RGNNV infected groupers

PPAR-δ基因在RGNNV抗感組和易感組的SNP統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表4)顯示：SNP-N5基因型頻率在易感組和抗感組中存在顯著差異分布(P<0.05)；SNP-N5的CC基因型在易感組中分布頻率為57.1%，在抗感組中分布頻率為37.5%，表明CC基因型與RGNNV易感性狀相關(guān)；而CT基因型在易感組中分布頻率為38.8%，在抗感組中分布頻率為60.4%，表明CT基因型與RGNNV抗性相關(guān)。

對(duì)8個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果(表5)顯示：SNP-N3、SNP-N4、SNP-N5、SNP-N6、SNP-N7和SNP-N8 這6個(gè)SNP位點(diǎn)高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TACGGT、AGTCAC、TGCGGT、TACCAT、AGTCAT、AACGGT和TGTCAT共7個(gè)單倍型(圖2)。將上述單倍型與石斑魚(yú)抗神經(jīng)壞死病毒抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示7個(gè)單倍型與石斑魚(yú)抗神經(jīng)壞死病毒抗性性狀均無(wú)顯著的相關(guān)性(P>0.05)。

表5 石斑魚(yú)PPAR-δ基因SNP連鎖單倍型與2種病毒抗性的關(guān)聯(lián)分析Table5 Association analysis between PPAR-δ SNPs linked haplotype and resistance of two viruses

3 討論與結(jié)論

3.1 PPAR-δ基因的SNP位點(diǎn)分布分析

在本研究中，在石斑魚(yú)對(duì)SGIV的易感和抗感群體中共篩查到9個(gè)SNP位點(diǎn)，全部位于內(nèi)含子區(qū)域，在石斑魚(yú)對(duì)RGNNV的易感和抗感群體中共篩查到8個(gè)SNP位點(diǎn)，除SNP-N 1位于外顯子區(qū)域外，其余均分布在內(nèi)含子區(qū)域，且SNP-N1產(chǎn)生的突變?yōu)橥x突變，對(duì)氨基酸編碼并不造成影響。盡管對(duì)SNP的研究表明，SNP位點(diǎn)既可能發(fā)生在編碼區(qū)也可能發(fā)生在非編碼區(qū)，但其發(fā)生在非編碼區(qū)的機(jī)率更大，這是由于相較于具有編碼功能的外顯子，內(nèi)含子在進(jìn)化上受到的壓力更小一些，故內(nèi)含子的核苷酸多態(tài)性和變異度會(huì)明顯高于外顯子[18]。盡管內(nèi)含子不參與基因的編碼功能，但其在機(jī)體中仍發(fā)揮著重要作用，內(nèi)含子對(duì)機(jī)體的mRNA前體起著調(diào)節(jié)其剪接、運(yùn)輸和降解的作用，此外，近年來(lái)的研究還表明內(nèi)含子對(duì)基因的表達(dá)也起著重要的調(diào)控作用[19]。因此我們推測(cè)，本研究中在PPAR-δ基因內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，也許與該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，其不同突變體通過(guò)影響PPAR-δ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)控功能，從而影響宿主的抗病性狀，在我們今后的研究中，會(huì)對(duì)該機(jī)制進(jìn)一步深入分析。

3.2 SNP位點(diǎn)在不同群體中的多態(tài)性分析

Botstein等[20]對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi)時(shí)提出，當(dāng)PIC大于0.50時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)；PIC大于或等于0.25而小于0.50時(shí)為中度多態(tài)性位點(diǎn)；PIC小于0.25時(shí)為低度多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示石斑魚(yú)PPAR-δ基因SNP位點(diǎn)在抗感組和易感組中均表現(xiàn)為低度或中度多態(tài)，并未出現(xiàn)高度多態(tài)位點(diǎn)。而在草魚(yú)、羅非魚(yú)等的免疫基因SNP位點(diǎn)分析中也發(fā)現(xiàn)，中度多態(tài)性位點(diǎn)較多，低度和高度多態(tài)性位點(diǎn)偏少，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于SNP位點(diǎn)為典型的二等位基因表達(dá)，本身多態(tài)性不高[21]，此外，用于篩選抗病性狀的群體會(huì)在養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)過(guò)自然選擇和人工選擇，淘汰掉抗病能力差的個(gè)體，導(dǎo)致群體多樣性下降，因此SNP位點(diǎn)的整體多態(tài)性不高。

Hardy-Weinberg平衡分析表明，在不同感染組群體中均檢測(cè)到不符合Hardy-Weinberg平衡的SNP位點(diǎn)，由于本研究中的試驗(yàn)群體均來(lái)自養(yǎng)殖場(chǎng)，而養(yǎng)殖場(chǎng)的親本是經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期人工選育過(guò)程而獲得的，因此群體遺傳多態(tài)性在選育過(guò)程中會(huì)逐漸降低，從而導(dǎo)致部分SNP偏離Hardy-Weinberg平衡。

3.3 SNP位點(diǎn)與病毒抗性性狀的關(guān)聯(lián)分析

SNP是第3代分子標(biāo)記技術(shù)，其具有分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高，易于分型等特點(diǎn)。近年來(lái)，SNP標(biāo)記技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物育種中得到廣泛應(yīng)用[22]。在草魚(yú)中，采用Snapshot法篩選與草魚(yú)呼腸弧病毒(GCRV)抗感/易感性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，結(jié)果表明在RIG-I(視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I)、TLR3(Toll樣受體3)和補(bǔ)體C6等許多重要免疫基因中均篩選到多個(gè)抗病相關(guān)SNP位點(diǎn)和單倍型，可以作為草魚(yú)抗出血病品系的構(gòu)建提供技術(shù)手段[23-25]。在羅非魚(yú)中，同樣利用Snapshot分型法，在LBP(脂多糖結(jié)合蛋白)、NOD 1(核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域1)和MCP-8(肥大細(xì)胞蛋白酶?8)等基因中篩選出多個(gè)與無(wú)乳鏈球菌抗性關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)和單倍型[26-28]。此外，基于高通量測(cè)序，全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分析等其他技術(shù)手段也分別在異育銀鯽、牙鲆、虹鱒、鯉魚(yú)等重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中分別篩選獲得與鯽皰疹病毒(CaHV)，鰻弧菌、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)和鯉皰疹病毒(CyHV-3)等病原抗性關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。

在PPARs基因SNP分子標(biāo)記研究方面，目前在人、鼠以及牦牛上已有相關(guān)研究，而在低等脊椎動(dòng)物上的研究鮮有報(bào)道。有研究對(duì)黑線(xiàn)倉(cāng)鼠繁殖相關(guān)基因PPAR-δ部分序列進(jìn)行SNP分析，發(fā)現(xiàn)其外顯子區(qū)域發(fā)生堿基突變的概率較大，與人類(lèi)研究結(jié)果一致，猜測(cè)與其功能有密切關(guān)系[29]。PPARs基因作為調(diào)控牦牛肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)候選基因，分析其基因多態(tài)性，并與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為牦牛分子育種提供了科學(xué)依據(jù)[30]。

在本試驗(yàn)中，在SGIV感染組中篩選到9個(gè)SNP位點(diǎn)，與抗病性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNPS7基因型頻率在易感組和抗感組中存在顯著差異分布(P<0.05)。該位點(diǎn)的TT和AA 2種純合子基因型與SGIV抗感性狀相關(guān)，而AT雜合子基因型與SGIV易感性相關(guān)。對(duì)9個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示：SNP-S4、SNP-S5和SNPS6這3個(gè)位點(diǎn)高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TTT、AAA、TAA和TAT共4個(gè)單倍型；SNP-S7、SNP-S8和SNP-S9這3個(gè)SNP位點(diǎn)高度連鎖，構(gòu)成單倍塊2，可形成CAG、TTA和CAA共3個(gè)單倍型。將上述單倍型與石斑魚(yú)抗虹彩病毒抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示上述單倍型與石斑魚(yú)抗虹彩病毒抗性性狀均無(wú)顯著的相關(guān)性(P>0.05)。在RGNNV感染群體中篩選到8個(gè)SNP位點(diǎn)，與抗病性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNP-N 5(g.2510C>T)基因型頻率在抗感組和易感組中存在顯著差異分布(P<0.05)，該位點(diǎn)的CC基因型與RGNNV易感性狀相關(guān)，CT基因型則與RGNNV抗性相關(guān)。連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，SNP-N3、SNP-N4、SNPN5、SNP-N6、SNP-N7和SNP-N8這6個(gè)SNP位點(diǎn)高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TACGGT、AGTCAC、TGCGGT、TACCAT、AGTCAT、AACGGT和TGTCAT共7個(gè)單倍型。將上述單倍型與石斑魚(yú)抗RGNNV性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示7個(gè)單倍型與石斑魚(yú)抗神經(jīng)壞死病毒抗性性狀均無(wú)顯著的相關(guān)性(P>0.05)。上述研究結(jié)果中篩選出來(lái)的與抗SGIV和RGNNV關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)及其基因型可以作為石斑魚(yú)抗病品種選育的候選分子標(biāo)記。

在本試驗(yàn)中，雖然抗性關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)與其他位點(diǎn)形成了高度連鎖的單倍塊，但并沒(méi)有單倍型與抗病性狀顯著關(guān)聯(lián)，通常情況下，將位于1條染色體上某一區(qū)域的1組相關(guān)聯(lián)的多個(gè)SNP等位位點(diǎn)稱(chēng)作為單倍型，其經(jīng)常被用于基因組關(guān)聯(lián)研究、復(fù)雜的致病基因或者重要經(jīng)濟(jì)性狀基因的定位以及多態(tài)性篩選研究中，相較于單個(gè)SNP位點(diǎn)的分析，其效應(yīng)分析更為可靠，基因型檢測(cè)工作也更為高效[31]。因此本研究這些單倍塊暫時(shí)無(wú)法用于石斑魚(yú)抗病品系的構(gòu)建工作中。

3.4 總結(jié)

本研究分析了石斑魚(yú)PPAR-δ基因組多態(tài)性及其與SGIV和RGNNV抗感/易感性狀的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)SNP-N5(g.2510C>T)與石斑魚(yú)RGNNV抗性顯著相關(guān)，SNP-S7(g.4595T>A)與SGIV抗性顯著相關(guān)(P<0.05)，該研究結(jié)果為石斑魚(yú)病毒性疾病的抗病選育工作提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。