朱宇琪，宋秀祖

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院，浙江 杭州 310009）

固有免疫是機(jī)體固有的、抵御病原體入侵的第一道屏障，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等參與其中，Toll樣受體（TLR）在固有免疫中扮演重要角色。當(dāng)致病因子如脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（Lta）等刺激細(xì)胞TLR 時，會誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和趨化因子，包括腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-1β和巨噬細(xì)胞炎性蛋白2（MIP2）等，以激活炎性反應(yīng)抵御病原體入侵[1]。近年來研究表明，TLR 在黑色素細(xì)胞中功能性表達(dá)，參與黑色素合成和黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)，并在黃褐斑和白癜風(fēng)的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本文圍繞TLR 在黑色素細(xì)胞中異常表達(dá)對色素性皮膚病發(fā)病的影響進(jìn)行綜述。

1 TLR 的結(jié)構(gòu)和功能

TLR 是一類參與固有免疫的跨膜蛋白。哺乳動物TLR 家族包括13 名成員，其中人類由TLR1～TLR10等10 名成員組成[2]。人類的固有免疫系統(tǒng)高度保守，可通過TLR 識別病原體相關(guān)分子模式（PAMP）對入侵機(jī)體的病原體做出即時反應(yīng)。在獲得性免疫中，樹突狀細(xì)胞中的TLR 信號也參與了初始T 細(xì)胞的激活過程[3]。TLR 在免疫細(xì)胞以外的細(xì)胞中也有表達(dá)，包括：角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞等。Yu 等[4]用特異性引物對體外擴(kuò)增的正常人黑色素細(xì)胞進(jìn)行mRNA 檢測：發(fā)現(xiàn)人黑色素細(xì)胞構(gòu)成性表達(dá)TLR1、2、3、4、6、7 和9，但不表達(dá)TLR 5、8和10。用抗人TLR 蛋白的特異性抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)人黑色素細(xì)胞表達(dá)TLR蛋白，證實(shí)了TLR 在皮膚黑色素細(xì)胞中的表達(dá)。

TLR 識別的配體主要有：微生物天然成分、天然物質(zhì)的合成類似物、小分子化合物，以及無菌炎性反應(yīng)期間宿主細(xì)胞釋放的內(nèi)源性成分等[5]。細(xì)胞表面TLR 主要識別微生物膜成分，如脂質(zhì)、脂蛋白和蛋白質(zhì)。單個TLR 可識別多種配體來觸發(fā)免疫反應(yīng)[6]。TLR 可通過其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與多種微生物PAMP 相互作用。在TLR 刺激下，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的激活和干擾素（IFN）-調(diào)節(jié)因子3 途徑分別啟動了促炎細(xì)胞因子（如IL-1 和TNF-α）的產(chǎn)生和Ⅰ型IFN（IFN-α 和IFN-β）的產(chǎn)生。因此TLR在早期宿主抵御入侵病原體的防御中起著至關(guān)重要的作用[5]。TLR 信號的激活需要TLR 的同源二聚化或異源二聚化，或與核心受體形成“m”形二聚體，夾在配體分子結(jié)構(gòu)之間，以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Toll/IL-1 受體（TIR）結(jié)構(gòu)域的二聚化，并觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)。TLR 的細(xì)胞內(nèi)TIR 結(jié)構(gòu)域二聚化的同時招募含有TIR 結(jié)構(gòu)域的適配蛋白，如髓樣分化初級應(yīng)答基因88 （MyD88）、含TIR 結(jié)構(gòu)域的適配蛋白（TIRAP）、誘導(dǎo)IFN-β 的含有TIR 結(jié)構(gòu)域的銜接子（TRIF）和TRIF 相關(guān)適配分子（TRAM）。根據(jù)適配蛋白的使用情況，TLR 信號又分為MyD88 依賴通路和TRIF 依賴通路。除了TLR3，所有的TLR 都使用MyD88 依賴的途徑來啟動信號傳遞，而TLR4 則利用MyD88 和TRIF 途徑[7]。

當(dāng)刺激人黑色素細(xì)胞TLR 時，促炎細(xì)胞因子（IL-8、IL-6）和趨化因子[CC 趨化因子配體2（CCL2）、CCL3、CCL5]的釋放顯著增加。而觸發(fā)TLR 2、3、4、7和9 則導(dǎo)致NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）的磷酸化和NF-κB 亞基p65 的核移位，表明培養(yǎng)的人黑色素細(xì)胞表達(dá)功能性TLR2、3、4、7 和9，且NF-κB 通路參與TLR2、3、4、7 和9 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，這也解釋了眾多促炎基因被激活的原因：TLRs 使人黑色素細(xì)胞成為皮膚固有免疫的活躍分子，參與了色素性皮膚病的發(fā)病[4]。

2 TLR 與黃褐斑

2.1 TLR2 與黃褐斑 TLR2 在健康皮膚中不表達(dá)或弱陽性表達(dá)，但在黃褐斑皮損處呈陽性表達(dá)，且表達(dá)明顯上調(diào)，表明黃褐斑發(fā)病中的炎性反應(yīng)可能與TLR2 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)[8]。Koike 等[9]研究表明，TLR2 激動劑單核細(xì)胞增生李斯特氏菌熱滅活制劑（HKLM）通過促進(jìn)人黑色素細(xì)胞的黑色素生成基因的表達(dá)，包括增加酪氨酸酶（TYR）的活性和表達(dá)，上調(diào)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、TYR、多巴色素互變異構(gòu)酶（DCT）的mRNA 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外黑色素和原本數(shù)量穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)黑色素增加，證明TLR2 通過促進(jìn)黑色素細(xì)胞黑色素生成來參與固有免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。黑素小體成熟和運(yùn)輸?shù)幕A(chǔ)是膜運(yùn)輸和囊泡轉(zhuǎn)化。人表皮包括微生物群在內(nèi)的微環(huán)境表達(dá)TLR 以感知外界信號，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子和抗菌肽保護(hù)人體。其中TLR2 促進(jìn)了人表皮黑色素細(xì)胞Rab11A 的表達(dá)，并利用與Rab11a 相關(guān)的黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)，來將黑素小體從黑色素細(xì)胞向鄰近角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而影響皮膚色素沉著及闡明炎性反應(yīng)后色素沉著的過程[10]。

2.2 TLR3 與黃褐斑 TLR3 激動劑聚肌胞苷酸[Poly（I：C）]通過TRIF 和線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）信號通路誘導(dǎo)Rab27A 的表達(dá)，增加了黑素小體向膜周區(qū)域的轉(zhuǎn)運(yùn)和向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，證明TLR3 信號通過促進(jìn)黑素小體轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細(xì)胞來響應(yīng)固有免疫系統(tǒng)的激活[9，11]。Koike 等[12]研究表明TLR3 刺激激活Ras 同源基因家族成員A（RHOA）和細(xì)胞分裂周期因子42（CDC42）的表達(dá)，肌動蛋白應(yīng)力纖維和絲狀偽足的形成分別發(fā)生改變，來誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用，從而促進(jìn)黑素小體進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞引起色素沉著。

2.3 TLR4 與黃褐斑 TLR4 在健康皮膚中不表達(dá)，但在黃褐斑皮損處表達(dá)明顯上調(diào)。表明黃褐斑發(fā)病機(jī)制中的炎性反應(yīng)除了TLR2 外，可能也與TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)[8]。人黑色素細(xì)胞在生理?xiàng)l件下表達(dá)TLR4 及其接頭分子CD14 和MyD88，而TLR4 和MyD88 的表達(dá)又受到LPS 的調(diào)節(jié)。其中CD14 作為接頭分子通過TLR4 增強(qiáng)LPS 的信號敏感性，而MyD88 又是TLR4 細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。LPS 可誘導(dǎo)人黑色素細(xì)胞黑色素合成但卻以濃度依賴的方式抑制黑色素細(xì)胞增殖，表明LPS 誘導(dǎo)的TLR4 表達(dá)可能在微生物誘導(dǎo)的黑色素合成中發(fā)揮作用[13]。Tam 等[14]研究表明在深膚色的黑色素細(xì)胞中TLR4 mRNA 水平高于淺膚色的黑色素細(xì)胞。而黑色素細(xì)胞TLR4mRNA 的表達(dá)受LPS 參與的NF-κB 通路調(diào)控，通路激活可增加黑色素細(xì)胞TLR4mRNA 的表達(dá)，并增強(qiáng)NF-κB p50 和p65 的DNA 結(jié)合活性，表明黑色素生成參與正常表皮黑色素細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。Song 等[15]研究表明，靜息狀態(tài)的新生兒黑色素細(xì)胞（NHMs）不表達(dá)TLR4，但LPS 刺激可誘導(dǎo)TLR4 表達(dá)，從而增加細(xì)胞色素沉著，并誘導(dǎo)局部炎性反應(yīng)。而反復(fù)紫外線照射，特別是戶外紫外線（UVB）治療后，NHMs TLR4 的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于經(jīng)LPS 治療后。表明黑色素細(xì)胞中的TLR4 信號通路與UVB 誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)之間可能存在關(guān)聯(lián)。Takabe 等[16]研究表明黑色素細(xì)胞周圍完整的透明質(zhì)酸涂層可以保護(hù)細(xì)胞免受紫外線輻射（UVR）等各種因素的傷害，當(dāng)透明質(zhì)酸涂層破裂時則通過NF-κB 激活增加UVB 誘導(dǎo)的TLR-4 受體信號和促炎介質(zhì)IL-6、IL-8、CXC 趨化因子配體1（CXCL1）和CXCL10 的表達(dá)，透明質(zhì)酸涂層的反復(fù)損傷參與激活UVB 誘導(dǎo)的持續(xù)反應(yīng)導(dǎo)致炎性發(fā)生。

2.4 TLR9 與黃褐斑 TLR9 激動劑ODN2006 刺激以劑量依賴性方式降低正常人皮膚黑色素復(fù)蘇細(xì)胞（PIG1）的活力，并提高促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-8 的產(chǎn)生。ODN2006 可不同程度地調(diào)節(jié)PIG1 黑色素細(xì)胞中PMEL、TYR 和TLR9 的表達(dá)，并以時間依賴性方式增加TLR9 表達(dá)，UVB 照射對這一過程具有疊加效應(yīng)。經(jīng)ODN2006 刺激的TLR9可進(jìn)一步激活NF-κB 促進(jìn)黑色素細(xì)胞的黑色素合成，提示在微生物誘導(dǎo)的黑色素合成中TLR9 可能發(fā)揮作用[17]。

3 TLR 與白癜風(fēng)

3.1 TLR3 與白癜風(fēng) Zhang 等[18]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測黑色素細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)壞死的角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的RNA 可刺激黑色素細(xì)胞ICAM-1 的表達(dá)，并誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞的促炎基因表達(dá)。而TLR3 可作為受體與受損細(xì)胞中釋放出來RNA 相互作用。這表明TLR3 可能通過誘導(dǎo)人黑色素細(xì)胞ICAM-1 等促炎基因表達(dá)，直接調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞功能及與免疫細(xì)胞間的相互作用，并參與皮膚物理創(chuàng)傷后白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。Yu 等[19]用免疫熒光法檢測體外擴(kuò)增的人表皮黑色素細(xì)胞TLR3 后發(fā)現(xiàn)，人黑色素細(xì)胞表達(dá)構(gòu)成性和誘導(dǎo)性TLR3，這表明人黑色素細(xì)胞可能通過TLR3 來識別病毒來源的致病基序。進(jìn)一步研究表明，黑色素細(xì)胞對雙鏈核糖核酸（dsRNA）的反應(yīng)性誘導(dǎo)凋亡作用依賴于TLR3[20]。TLR3 介導(dǎo)的黑色素細(xì)胞凋亡需要自分泌IFN-β。病毒感染曾被認(rèn)為是白癜風(fēng)中黑色素細(xì)胞破壞的誘因，推測病毒dsRNA 通過激活人黑色素細(xì)胞中的TLR3 并自分泌IFN-β 來誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞的凋亡。

3.2 TLR7 與白癜風(fēng) Yu 等[3]研究表明，與正常黑色素細(xì)胞比較，白癜風(fēng)皮損周圍皮膚的黑色素細(xì)胞凋亡率顯著升高，白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8 和可溶性ICAM-1（sICAM-1）也明顯增多，但白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞的酪氨酸酶活性及黑色素含量均顯著低于正常黑色素細(xì)胞。白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞TLR7 表達(dá)明顯高于正常黑色素細(xì)胞，表明TLR7 可能與白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞的功能紊亂相關(guān)[3]。Traks 等[21]研究表明，TLR7 單核苷酸多態(tài)性（SNP）與白癜風(fēng)易感性存在關(guān)聯(lián)，表明除了部分炎癥性皮膚病以外，TLR 還影響白癜風(fēng)的疾病發(fā)展。TLR7 激動劑咪喹莫特的局部使用可能引起局限性白癜風(fēng)或白癜風(fēng)樣色素減退[22]。Kang 等[23]研究表明，咪喹莫特對人黑色素細(xì)胞有直接作用，降低了小眼癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）和酪氨酸酶蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致色素的減少。同時，經(jīng)咪喹莫特刺激的黑色素細(xì)胞生長受到抑制。因此，外用咪喹莫特引起的白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制可能與咪喹莫特通過TLR7 依賴性機(jī)制抑制人黑色素細(xì)胞增殖和黑色素生成相關(guān)。

3.3 TLR9 與白癜風(fēng) Yu 等[3]研究表明，TLR9 在白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞中表達(dá)增加，可能與白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。TLR7 和TLR9 有相似的結(jié)構(gòu)和功能，并分別通過識別自身RNA 參與自身免疫，但在自身免疫性疾病中的作用可能有所不同。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的小鼠模型中，TLR9 基因缺陷小鼠的自身免疫性疾病加重，而TLR7 基因缺陷小鼠的病情則有所改善，二者起著相反的炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)作用[24]。SLE患者B 細(xì)胞中TLR9 的低反應(yīng)性可能代表某種保護(hù)機(jī)制的喪失，從而導(dǎo)致自身免疫的啟動或增強(qiáng)[25]。TLR 交易伴隨基因UNC93B1 通過招募syntenin-1以抑制TLR7 信號并防止自身免疫，但不限制TLR9的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。因此推測在白癜風(fēng)患者對黑色素細(xì)胞的自身免疫作用下，這2 種TLR 的表達(dá)增加可能是由于皮損內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的競爭所致[26]。

綜上，本文對TLR 在黑色素細(xì)胞中異常表達(dá)與色素性皮膚病發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行了綜述與討論。TLR 可通過誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞黑色素生成和炎性因子釋放，并參與免疫反應(yīng)。黑色素細(xì)胞及黑色素生成過程的異常與色素性皮膚病緊密相關(guān)，黃褐斑的發(fā)病一般認(rèn)為與黑色素細(xì)胞黑色素生成增加有關(guān)，而白癜風(fēng)則存在功能性黑色素細(xì)胞的缺失。TLR 也被證明在色素性皮膚病中的表達(dá)發(fā)生改變，其中TLR2 和TLR4 在黃褐斑發(fā)病中發(fā)揮作用，TLR3、7 和9 均參與白癜風(fēng)的發(fā)病，但TLR 在其中參與的具體環(huán)節(jié)尚未完全闡明，對TLR 及其對黑色素細(xì)胞影響的進(jìn)一步深入研究，對色素性皮膚病的發(fā)病機(jī)制的闡明有重要意義。