王松，冉栓，牛裕晴，吳杰，夏家紅（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，湖北 武漢 430022）

細胞焦亡（pyroptosis）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡方式，多項研究表明焦亡參與了腫瘤、自身免疫性疾病、感染等多種疾病的病理過程。心臟移植排斥反應主要病理過程是抗原提呈細胞等固有免疫細胞捕獲外來抗原并活化T 細胞等獲得性免疫細胞，活化后的T 細胞通過直接殺傷或激活巨噬細胞等天然免疫細胞參與移植物的排斥反應。越來越多的證據(jù)表明焦亡可能參與到心臟移植排斥反應過程，本文將針對焦亡在心臟移植排斥中潛在作用的研究進展進行闡述，加深對移植排斥反應的認識，通過靶向焦亡的相關通路為臨床治療提供新策略。

1 細胞焦亡

細胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由Gasdermin蛋白介導的細胞程序性死亡［1］，表現(xiàn)為細胞腫脹破裂，內容物釋放。經(jīng)典的焦亡途徑是指病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）或者損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）被細胞模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別，從而激活下游信號，與前體半胱天冬酶（pro-Caspase-1）以及凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）組裝形成炎癥小體（inflammasome），再激活pro-Caspase-1，活化后的Caspase-1 切割二聚體狀態(tài)Gasdermin，N 端Gasdermin 在細胞膜上形成孔道。同時被成熟Caspase-1 激活的IL-1β、IL-18 及HMGB1 等炎癥因子，通過孔道釋放到細胞外基質，導致細胞的焦亡。非經(jīng)典焦亡途徑主要由Caspase-11 介導。AIM2炎癥小體作為PRR 來感受DNA 的損傷信號，AIM2介導的細胞焦亡不依賴于Caspase-1、IL-1β 及IL-18［2］。Caspase-1/4/5/11 都參與焦亡相關通路。Gasdermin 蛋白家族主要成員有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD 及GSDME，而GSDMD 是其中重要成員之一，是細胞發(fā)生焦亡的執(zhí)行者［3-13］。

焦亡與另外一種經(jīng)典的程序性細胞死亡——凋亡不同。凋亡過程表現(xiàn)為染色質固縮，核膜破裂，形成凋亡小體，通過細胞內在分子程序導致細胞死亡，對周圍正常組織及細胞無其他影響［7］。而細胞焦亡發(fā)生時胞核完整，僅細胞質發(fā)生腫脹，形成炎癥小體，內容物流出，釋放炎癥因子，誘發(fā)細胞外部炎癥［14］。

2 焦亡在免疫相關疾病中的作用

2.1 自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種由自身免疫反應導致的肝炎。在AIH 中，輔助性Ⅰ型T 細胞（helper type Ⅰ T cells，Th1）刺激巨噬細胞分泌IL-1 和TNF-α，IL-1β 與IL-18 都屬于IL-1 家族蛋白。伴刀豆凝集素A（concanavalin A，ConA）構建自身免疫性肝炎動物模型，經(jīng)ConA處理后，NLRP3 炎癥小體、剪切后的Caspase-1 以及IL-1β 表達上調。與野生型小鼠相比，NLRP3-/-小鼠肝細胞損傷明顯降低，血清丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平降低，肝細胞勻漿中Caspase-1和IL-1β 蛋白水平下調［15］。其研究表明抑制肝細胞焦亡可以明顯改善自身免疫性肝炎。

在酒精性肝炎中，敲除非經(jīng)典通路中關鍵分子Caspase-11 可以抑制GSDMD 的激活，減少肝細胞死亡。焦亡的下游效應分子IL-18 被認為是促炎因子，同時也是重要的抗微生物細胞因子。但在酒精性肝炎中，IL-18 的缺乏并不能保護肝臟，反而會促進GSDMD 的激活，加速肝細胞死亡從而加重肝炎［16］。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一種以肝臟炎癥及肝臟纖維化為特征的非酒精性脂肪性肝病。近期有研究表明，在NASH 中，肝星狀細胞吞噬細胞外NLRP3 炎癥小體顆粒后通過經(jīng)典途徑激活Caspase-1，使肝臟星狀細胞發(fā)生焦亡，導致IL-1β 的釋放，過表達NLRP3 可以導致小鼠出現(xiàn)自發(fā)性肝纖維化，加重非酒精性脂肪肝炎［17］。

2.2 焦亡在自身免疫性腦脊髓炎中的作用：實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）動物模型是用來研究多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）自身免疫性疾病的理想模型。MS以神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及脫髓鞘為主要表現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在其中扮演著重要的角色［18］。作為NLRP3 下游，焦亡的關鍵分子GSDMD 在EAE 發(fā)病小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達升高，主要聚集在血管周圍區(qū)域附近。使用GSDMD 敲除鼠誘導EAE 發(fā)現(xiàn)，外周髓系細胞的GSDMD 缺失抑制了免疫細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤，導致神經(jīng)炎癥和脫髓鞘發(fā)生的比例減少。此外，敲除GSDMD 減少了脾臟及引流淋巴結中T 細胞的活化和分化，并阻止了T 細胞浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，敲除小鼠Gsdmd 基因后，明顯減輕EAE 發(fā)病嚴重程度［19］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在EAE 模型中少突膠質細胞發(fā)生焦亡后，可以募集更多的小膠質細胞在其周圍聚集［20］。EAE 模型中，巨噬細胞中Vsig4 可以激活JAK2-STAT3-A20級聯(lián)反應，通過抑制NF-κB 通路來降低NLRP3 及IL-1β 的表達。敲除Vsig4 明顯加重EAE 的發(fā)病程度［21］。因此靶向Vsig4 調控細胞焦亡可能成為治療多發(fā)性硬化的新靶點。但是AIM2 全敲小鼠誘導EAE 之后臨床評分更高、神經(jīng)炎和脫髓鞘更嚴重，這可能與AIM2 破壞了Treg 的穩(wěn)定有關［22］。

2.3 焦亡在腫瘤中的作用

2.3.1 細胞焦亡在乳腺癌中的作用：乳腺癌中GSDMB 的高表達與腫瘤進展和對HER-2 靶向治療反應差相關，高水平的GSDMC 表達與乳腺癌的預后不良相關［23-24］。這意味著GSDMB、GSDMC 有可能成為腫瘤預后不良的標志物。在使用EO771 大鼠腫瘤細胞構建原位乳腺癌模型中，野生型小鼠中IL-1β 的水平升高，腫瘤生長迅速且肺轉移發(fā)生比例高。而Caspase-1 敲除的小鼠構建腫瘤模型，腫瘤生長明顯減緩且肺轉移明顯減少。此外IL-1β 可以促進腫瘤及巨噬細胞表達趨化因子CCL2，募集髓系細胞到炎癥部位，并促進巨噬細胞浸潤到腫瘤中［25］。此外，IL-1β 還可以促進乳腺癌細胞的轉移及增殖，增加的骨轉移［26］。

2.3.2 細胞焦亡與肺癌：GSDMD 蛋白在非小細胞肺癌中表達明顯升高，且GSDMD 的高表達會導致腫瘤侵襲性強，腺癌預后差。下調GSDMD 后，腫瘤細胞焦亡受抑制，凋亡增加，并通過EGFR/Akt 通路減弱腫瘤細胞增殖［27］。He 等［5］在巨噬細胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：GSDMD 敲除后，巨噬細胞不發(fā)生焦亡，而是通過Caspase-3/7 通路發(fā)生凋亡。模式識別受體AIM2 激活后形成炎癥小體，在非小細胞肺癌細胞中高表達AIM2，可以增強非小細胞肺癌的活力以及加強其遷移能力，在體內促進腫瘤的生長［28］。以上研究表明，焦亡在肺癌中的水平與肺癌的炎癥程度、轉移能力及預后相關，有望成為重要的生物標志物。

2.3.3 細胞焦亡與黑色素瘤：聯(lián)合使用BRAF 抑制劑及MEK 抑制劑是FDA 批準的治療BRAFV600E/K突變的黑色素瘤的有效方法［29］。BRAF 抑制劑 +MEK 抑制劑誘導了GSDME 介導的焦亡細胞死亡，在GSDME 敲除小鼠中，腫瘤浸潤的T 細胞減少，且在聯(lián)合治療中不發(fā)生焦亡［30］。另外一種模式識別受體NLRP1 不需要ASC 便可以激活Caspase-1 形成炎癥小體，NLRP1 通過增強炎癥小體和抑制巨噬細胞凋亡來促進黑色素瘤的生長［31］。因此，焦亡相關分子NLRP1 可能成為治療人黑色素瘤的新靶點。NLRC4 在黑色素瘤中可以抑制黑色素瘤的生長，NLRC4 炎癥小體由NLRC4、ASC 與Caspase-1組成，敲除ASC 與Caspase-1 不能抑制移植黑色素瘤的生長，說明NLRC4 抑制黑色素瘤的生長不通過NLRP3 炎癥小體途徑［32-33］。

隨著研究的深入，細胞焦亡與腫瘤的關系逐漸被認識。細胞焦亡與肝細胞癌、胃癌、結直腸癌及白血病等都密切相關［4］。一部分腫瘤細胞可以有效調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，激活T 細胞介導的強大抗腫瘤免疫反應［34］。靶向焦亡相關蛋白AIM2、NLRP3炎癥小體、Caspase-1 以及Gasdermin 蛋白有望成為抑制腫瘤生長，治療耐藥性腫瘤、預防腫瘤轉移的有效途徑［34-38］。

3 焦亡在器官移植中的作用

實體移植目前仍然是終末期器官衰竭的最終治療手段［39］。器官移植術后，移植物經(jīng)歷缺血/再灌注損傷、排斥反應等過程，天然免疫和適應性免疫在其中扮演著重要的作用。

3.1 焦亡與缺血/再灌注損傷：缺血/再灌注損傷（ischemic reperfusion injury，IRI）是指由于各種原因引起的缺血和血液灌注恢復引起的組織或者器官損傷。在肝、腎、肺及心臟移植中，缺血/再灌注損傷是影響早期功能恢復和長期存活的主要原因之一。之前的研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機制及治療策略主要涉及線粒體的功能：電子傳遞體系、線粒體滲透性改變以及自噬相關。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，焦亡在缺血/再灌注損傷中也有著重要的作用［40］。在體外肺灌注的過程中，來自供體肺的白細胞通過Caspase-1誘導的細胞焦亡來損傷肺移植物，如果清除這些白細胞或者抑制焦亡，可以明顯延長肺移植物的存活時間［41］。SIRT1 激動劑在IRI 缺血性損傷期間，可通過Akt 依賴性代謝調節(jié)抑制NLRP3 炎性小體的激活［42］。多種焦亡相關抑制劑已被證明可通過抑制心肌細胞焦亡減輕小鼠心肌梗死面積、改善心功能障礙，抑制劑Ac-YVAD-cmk［43］與VX765［44-45］通過抑制Caspase-1 抑制心肌細胞焦亡,抑制劑MX1013可以抑制多種Caspase 蛋白激活［46］,大黃素（emodin）通過抑制GSDMD 表達從而抑制心肌細胞焦亡［47］。GSDMD 全敲小鼠對心肌IRI 具有抗中性粒細胞介導的心臟保護作用［48］。此外，使用MCC950 和Ac-YVAD-cmk 阻斷焦亡通路的NLRP3 炎癥小體或者Caspase-1 可以減輕因心臟驟停后神經(jīng)系統(tǒng)損傷［49］。SHI 等［50］2021 年發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷選擇性的激活心肌細胞中Caspase-11 而不是Caspase-1，從而剪切GSDMD。隨后他們構建心肌細胞條件性敲除GSDMD（GSDMDflox/flox；CreαMHC）的小鼠，發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注的敲除小鼠中心肌梗死面積明顯減輕，LDH 釋放明顯減少，且心肌細胞凋亡沒有明顯差異。以上研究表明靶向焦亡可以明顯減輕缺血/再灌注損傷。

3.2 焦亡相關分子與排斥反應：在2010 年有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟移植急性排斥階段，炎癥小體相關的ASC 在移植物中升高，且IL-1β 升高，其中機制不明［51］，受體小鼠Nos2 敲除后，Caspase-1 的轉錄水平明顯降低，減輕心臟移植排斥反應［52］，當時認為以上過程是細胞凋亡的結果，目前來看，此過程很有可能跟細胞焦亡密切相關。急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，GvHD）仍然是使用同種異體造血干細胞移植治療惡性造血系統(tǒng)腫瘤的主要障礙。Caspase-11 激活后切割GSDMD，導致IL-1α 釋放。Caspase-11 或者GSDMD 缺乏可以減輕同種異體造血干細胞移植后的腸道炎癥、組織損傷，降低移植后的病死率。此外，Caspase-11 的缺乏不會產生移植物抗白血病效應，這對防止癌癥復發(fā)至關重要［53］。在同種異體心臟移植中，冬凌草甲素（oridonin）可以通過NF-κB 通路抑制T 細胞的增殖和IFN-γCD4+T 細胞的分化，導致脾臟中Treg的比例增加，下調NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和IL-18 的表達，延長心臟移植物存活時間［54］。

此外，在器官移植排斥反應中，T 細胞起著重要作用，CD4+T 細胞是心臟移植和腎移植中急性排斥反應充分且必要條件［55-56］，目前有大量CD4+T細胞在器官移植急性排斥反應中的研究。CD4+T 細胞分為Th1、Th2、Th17、Treg 及Tfh 細胞亞群。闡明CD4+T 細胞與焦亡的關系，有望為防止心臟移植排斥反應提供新的治療策略。NLRP3 炎癥小體在CD4+T 細胞中組裝然后激活Caspase-1 依賴的IL-1β 分泌，從而促進IFN-γ 的產生，進一步促進CD4+T 細胞分化為Th1 型輔助T 細胞，且此過程需要補體激活NLRP3［57］。NLRP3 缺乏影響T 細胞激活及Th1 的分化，還會調節(jié)致病性T 細胞向胰島遷移［58］。有研究表明，NLPR3 抑制劑MCC950 顯著降低Th1/17 的細胞比例及IFN-γ 和IL-17 的分泌，增加Treg 的比例及IL-10 的分泌，而且此過程是由IL-1β 和IL-18 分泌受抑制介導的，從而減輕同種異體器官移植及角膜移植的排斥反應［59-60］。靶向焦亡相關分子NLRP3 有望成為同種異體移植的新的治療策略。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，AIM2 通過與RACK1-PP2A 磷酸化復合物的交互作用抑制AKT 的磷酸化，從而促進Treg 的穩(wěn)定［22］。AIM2 通過增強Treg 的穩(wěn)定，減輕適應性免疫應答。

作為天然免疫細胞的巨噬細胞，在免疫排斥反應中也發(fā)揮重要作用。在心臟移植術后患者心內膜活檢中，有超過半數(shù)的移植物中存在炎癥，有約1/3 的標本中沒有CD4+和CD8+T 細胞，而是存在不同表型的巨噬細胞［61］。巨噬細胞有供體和受體兩種來源，研究表明，供體來源的巨噬細胞調控心臟移植排斥反應和GvHD［62-63］。在慢性排斥反應中，單核巨噬細胞CX3CR1/CX3CL1 和RhoA信號通路的相關性為抗慢性排斥療法提供潛在靶點［64］。移植物血管病變是慢性排斥反應的重要病理過程，有研究表明，PCSK9 抑制了移植物血管中巨噬細胞的募集及IL-1β 及IL-18 的表達，這與抑制NLRP3 的表達有關［65］。焦亡最早在巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)，Caspase-1/4/5/11 被炎癥小體激活后，切割GSDMD，N 端的GSDMD 在細胞膜上打孔，細胞發(fā)生焦亡，釋放IL-1β 及HMGB1［1，5］。

4 細胞焦亡在心臟移植排斥反應中的潛在作用

細胞焦亡在多種疾病中主要發(fā)揮促炎效應，而在心臟移植排斥反應中，無論是由適應性免疫T細胞介導，還是由天然免疫巨噬細胞參與，炎癥都在其中扮演著重要的角色。受限于目前研究手段，心臟移植后的缺血/再灌注損傷、急性和慢性排斥反應發(fā)生發(fā)展過程的界定尚未明確，它們間的交互作用尚待研究。有研究表明，高親和力的CAR-T 細胞介導腫瘤靶細胞發(fā)生焦亡，釋放炎癥因子IL-1β及IL-18，可以募集更多的巨噬細胞在局部聚集［66］。IL-1β 可以促進巨噬細胞表達趨化因子CCL2，募集到炎癥部位［25］。而在心臟移植排斥反應中，表達CCL2 的巨噬細胞調節(jié)排斥反應［62］，由此我們提出一種假設：在心臟移植后，T 細胞殺傷心肌細胞，導致心肌細胞發(fā)生焦亡，釋放炎癥因子IL-1β，募集供體高表達CCR2 的巨噬細胞向移植物聚集，進一步加強炎癥反應，移植物焦亡將適應性免疫與天然免疫聯(lián)系起來（圖1）。靶向焦亡的執(zhí)行者——GSDMD，有望切斷上述聯(lián)系，減輕移植物單核細胞的浸潤，延長移植物生存時間，為減輕心臟移植排斥反應提供潛在的治療新策略。

圖1 細胞焦亡在心臟移植排斥反應中的作用假設圖

5 總結與展望

細胞焦亡作為一種細胞程序性死亡方式，在多種疾病進程中發(fā)揮重要作用，其參與了自身免疫疾病、腫瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等病理過程。深入探究心臟移植排斥反應中焦亡的作用與機制有助于我們更進一步認識排斥反應的病理過程，靶向細胞焦亡有望成為移植物排斥反應治療或輔助治療的有效手段。同一種疾病中不同細胞的焦亡可能發(fā)揮同向作用或反向作用，挖掘心臟移植中不同細胞焦亡在其中發(fā)揮的作用及意義有望助于新一類抗排斥藥物的研發(fā)。