孫冬梅，丁 青，劉曉霞，陶晨璐，劉艷梅，李振雨，朱德全，陳向東

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑可用于標(biāo)化臨床用藥，保障用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性，規(guī)范目前臨床廣泛使用的包括配方顆粒在內(nèi)的新型飲片形式[1]。

山銀花，主產(chǎn)于湖南南部及西部、廣西東北部、貴州東部和西北部[2]，為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、華南忍冬Lonicera confusaDC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[3]。山銀花味甘，性寒，歸肝、心、肺經(jīng)，有清熱解毒、疏風(fēng)散熱之功。其主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱。目前，從山銀花中已分離鑒定出200多種化合物，主要包括有機(jī)酸類、黃酮類、三萜皂苷類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類等[4]。山銀花中的酚酸類成分對(duì)多種致病菌和病毒具有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，皂苷類成分具有保肝作用[5]。山銀花的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道多集中于藥材、飲片等原料的質(zhì)量研究[6-8]，而關(guān)于山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量研究?jī)?nèi)容頗少。本研究收集了15批來(lái)自廣西壯族自治區(qū)桂林市、湖南省邵陽(yáng)市、湖南省懷化市、貴州省遵義市的山銀花藥材，并按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法制備成山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜結(jié)合多成分定量測(cè)定的檢測(cè)方法，以及對(duì)共有指紋峰采用Q-Orbitrap MS/MS技術(shù)進(jìn)行鑒定，對(duì)山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)，旨在為以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為基礎(chǔ)的其他山銀花制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 VanquishTM超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Q-Exactive-Orbitrap型Thermo Vanquish Flex超高效液相-Thermo Fisher 高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD）（賽默飛世爾科技有限公司）；Waters ACQUITY HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ME204E型萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO公司）；XP26型百萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO 公司）；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ-500DE型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201817，含量：96.80%）、灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品（批號(hào)：111814-201604，含量：94.40%）、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品（批號(hào)：111813-201804，含量：96.80%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)：wkq18030107，含量：98.0%）、異綠原酸A（批號(hào)：wkq18041207，含量：98.0%）、異綠原酸C（批號(hào)：wkq18050905，含量：98.0%）、異綠原酸B（批號(hào)：wkq21022206，含量：98.0%）均購(gòu)于四川維克奇生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，購(gòu)自默克股份有限公司；甲酸為色譜純，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇為分析純，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸為色譜純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Milli-Q超純水實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 材料 試驗(yàn)用15批山銀花于2020年6—7月采摘，采摘后的藥材以蒸汽殺青，置50～55 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，即得。樣品依次編號(hào)為S1～S15，樣品信息見(jiàn)表1，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.。15批樣品按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》山銀花項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，符合規(guī)定。

表1 山銀花樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取山銀花飲片100 g，置電熱陶瓷壺中，加水煎煮2次，第1次煎煮加12倍量水，浸泡30 min，武火（500 W）加熱煮沸后文火（200 W）保持微沸30 min，用350目篩趁熱過(guò)濾，濾液迅速用冷水冷卻；第2次煎煮加10倍量水，武火（500 W）加熱煮沸后文火（200 W）保持微沸25 min，用350目篩趁熱過(guò)濾，濾液迅速用冷水冷卻；合并2次濾液，減壓濃縮至清膏體積約為150 mL，分裝至10 mL西林瓶中，每瓶分裝2 mL，真空冷凍干燥，取出，軋鋁蓋，即得。

2.2 指紋圖譜方法

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品2.801 mg、新綠原酸對(duì)照品2.297 mg、異綠原酸A對(duì)照品2.328 mg、異綠原酸C對(duì)照品2.130 mg、灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品2.067 mg、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品2.146 mg、異綠原酸B對(duì)照品2.129 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為542.274、450.212、456.288、417.480、390.250、415.466、417.284 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液a。取隱綠原酸對(duì)照品2.122 mg，置于5 mL溶量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度415.912 μg/mL的對(duì)照品溶液b。

2.2.2 供試品溶液的制備 取山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～1 min，7%A～10%A，1～9 min，10%A～21%A，9～24 min，21%A～42%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑S1供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以16號(hào)峰（異綠原酸A）為參照峰，計(jì)算21個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.03%～0.24%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在0.26%～0.86%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑S1供試品溶液，于室溫下放置，分別在制備后的2、5、8、13、16 h，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以16號(hào)峰（異綠原酸A）為參照峰，計(jì)算21個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.17%～0.89%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在1.05%～2.13%范圍內(nèi)，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑6份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以16號(hào)峰（異綠原酸A）為參照峰，計(jì)算21個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.14%～0.49%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在0.97%～2.43%范圍內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜測(cè)定與分析 取15批不同產(chǎn)地的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖，并將所有的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012版進(jìn)行分析。以S1為參照?qǐng)D譜，對(duì)15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰進(jìn)行匹配，選擇分離度較好，峰型對(duì)稱，峰純度高的色譜峰為指紋峰，共標(biāo)定21個(gè)指紋峰，共有峰模式見(jiàn)圖1，山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑S1和對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖2。采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度計(jì)算，15批不同產(chǎn)地的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品相似度在0.90以上，表明不同產(chǎn)地的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度較高。由于16號(hào)峰峰面積較大，成分已知，出峰位置居中，因此選擇16號(hào)峰（異綠原酸A）為參照峰，計(jì)算15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.04%～0.64%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在18.80%～123.73%范圍內(nèi)。

圖1 15 批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜

圖2 HPLC 色譜圖

2.4.1 聚類分析 采用SPSS 20.0軟件，對(duì)15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Ward法，以平方歐氏距離為測(cè)度，全矩從0到1標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)分類間距離在15時(shí)，山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑被分為4類，其中S1、S4～S12、S14～S15聚為一類，S2、S3、S13各自聚為一類；而S2、S3、S13都來(lái)自于廣西壯族自治區(qū)桂林市；分類結(jié)果表明當(dāng)前方法不可區(qū)分不同產(chǎn)地的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑，相同產(chǎn)地或不同產(chǎn)地的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑既具有相似性又具有差異性。

圖3 15 批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚類分析樹(shù)狀圖

2.4.2 主成分分析 采用SPSS 20.0軟件，將15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率及主成分得分。以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，提取出的主成分有5個(gè)，累積方差貢獻(xiàn)率為87.340%，表明提取出的5個(gè)主成分反映了15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的主要信息，碎石圖進(jìn)一步說(shuō)明了5個(gè)主成分可以表征山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的整體特征。（見(jiàn)圖4）根據(jù)載荷矩陣分析結(jié)果，可知，主成分1與10個(gè)指紋峰有關(guān)，主成分2與11個(gè)指紋峰有關(guān)，主成分3與10個(gè)指紋峰有關(guān)，主成分4與16個(gè)指紋峰有關(guān)，主成分5與12個(gè)指紋峰有關(guān)，表明山銀花的質(zhì)量差異是由多個(gè)成分共同作用引起。（見(jiàn)表2）

表2 15 批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑載荷矩陣圖

圖4 15 批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑主成分分析碎石圖

2.4.3 正交偏最小二乘法判別分析 為了進(jìn)一步研究不同批次間山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量差異，將15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰峰面積同時(shí)導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），以21個(gè)指紋峰峰面積為變量建立OPLS-DA。根據(jù)結(jié)果可知，R2x為0.993，R2y為0.826，Q2為0.787，表明模型可靠，預(yù)測(cè)程度較好。根據(jù)變量權(quán)重VIP值篩選引起不同批次之間質(zhì)量差異的特征性成分，選取VIP值＞1的變量指標(biāo)為質(zhì)量標(biāo)志物。結(jié)果表明，在21個(gè)指紋峰中峰3、峰5（新綠原酸）、峰6、峰7、峰11（隱綠原酸）、峰12、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰21（川續(xù)斷皂苷乙）的VIP值均大于1。（見(jiàn)圖5）這些成分是15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑之間產(chǎn)生差異的主要原因，為了更加全面、有效評(píng)價(jià)山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注上述成分的質(zhì)量變化。

圖5 15 批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑各成分VIP 值圖

圖6 山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑負(fù)離子模式（A）和正離子模式（B）下一級(jí)離子流圖

2.5 共有峰的鑒定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫，0～1 min，7%A～10%A，1～9 min，10%A～21%A，9～24 min，21%A～42%A；24～48 min，42%A～100%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2.5.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓為3.2 kV(+/-)，S-lens電壓為50 V；鞘氣流速為35 arb；輔助氣流速為10 arb；毛細(xì)管溫度為350 ℃；質(zhì)荷比范圍為100～1 500；數(shù)據(jù)采集模式：正負(fù)離子同時(shí)掃描（Full ms dd-MS2 Discovery）；分辨率為17 500，碰撞能（NCE）為20 V。

取“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，得到山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑正、負(fù)離子模式下的一級(jí)離子流及二級(jí)離子流圖。（見(jiàn)圖3）根據(jù)實(shí)際測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量與理論相對(duì)分子質(zhì)量二者偏差小于5 ppm，同位素豐度比及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息以及文獻(xiàn)報(bào)道等，結(jié)合Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)、Thermo m/z Vault數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)21個(gè)共有指紋峰進(jìn)行化合物推斷鑒別，鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。其中8種成分采用對(duì)照品對(duì)比確認(rèn)，分別為峰5（新綠原酸）、峰9（綠原酸）、峰11（隱綠原酸）、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰19（灰氈毛忍冬皂苷乙）、峰21（川續(xù)斷皂苷乙）；其余13個(gè)成分根據(jù)產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)推導(dǎo)；例如保留時(shí)間為1.20 min的峰1，正離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為（m/z）268.103 7，二級(jí)裂解碎片可見(jiàn)（m/z）136.061 6、（m/z）137.066 0，通過(guò)Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)、Thermo m/z Vault數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定該化合物為腺苷；保留時(shí)間為3.68 min的峰5，負(fù)離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為（m/z）353.087 7，二級(jí)裂解碎片可見(jiàn)（m/z）179.034 1、（m/z）191.055 4、（m/z）192.058 7，通過(guò)Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)、Thermo m/z Vault數(shù)據(jù)庫(kù)以及對(duì)照品比對(duì)確定該化合物為新綠原酸；保留時(shí)間為4.93 min的峰8，負(fù)離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為（m/z）389.108 8，二級(jí)裂解碎片可見(jiàn)（m/z）345.119 3、（m/z）209.048 8，通過(guò)Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)以及文獻(xiàn)報(bào)道鑒定該化合物為斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯。

表3 山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有指紋峰化學(xué)成分鑒定結(jié)果

2.6 多成分含量測(cè)定 山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜化學(xué)劑量分析結(jié)果表明峰3、峰5（新綠原酸）、峰6、峰7、峰11（隱綠原酸）、峰12、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰21（川續(xù)斷皂苷乙）為質(zhì)量標(biāo)志物，而峰9（綠原酸）、峰19（灰氈毛忍冬皂苷乙）既為共有峰，且成分已知，因此本試驗(yàn)在指紋圖譜的基礎(chǔ)上，對(duì)上述已采用對(duì)照品確定的8種成分進(jìn)行含量測(cè)定。

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液a 1 mL，分別置于2、5、10、20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣分析。精密吸取對(duì)照品溶液b 1 mL，分別置于2、5、10、20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣分析。記錄8種成分的峰面積，以進(jìn)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 8 種成分的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄8種成分的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的峰面積RSD值在0.23%～0.96%范圍內(nèi)，表明儀器的精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1）供試品溶液，分別在制備后的0、2、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄8種成分的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值，結(jié)果顯示在24 h內(nèi)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的峰面積RSD值在0.23%～0.99%范圍內(nèi)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1）樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。記錄8種成分的峰面積，并計(jì)算含量的RSD值。結(jié)果表明8種成分含量的RSD值在0.23%～2.13%范圍內(nèi)，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1）樣品，按對(duì)照品加入量與供試品中待測(cè)成分含量之比分別為0.5∶1、1∶1、1.5∶1設(shè)計(jì)3組，每組平行3份，分別加入8種待測(cè)成分對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄8種成分的峰面積，計(jì)算各成分含量及加樣回收率。結(jié)果顯示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的平均加樣回收率分別為100.45%、96.38%、98.47%、103.11%、100.27%、98.59%、99.13%、99.46%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好

2.6.6 樣品測(cè)定 對(duì)15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉中的8種成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 15 批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中8 種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由于山銀花中有機(jī)酸類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類成分較多，因此山銀花指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)多集中在230～240 nm[11-12]或330～360 nm[13]。本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在210 nm下指紋峰數(shù)量最多，峰容量更大；由于山銀花中的專屬性成分灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙共軛系統(tǒng)少，在其他檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)法檢出，因此在指紋圖譜和含量測(cè)定中以210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)以全面表征山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的物質(zhì)信息。

3.2 指紋圖譜分析 本研究采用了聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析3種模式識(shí)別方法，篩選到10種差異性質(zhì)量標(biāo)志物，分別為峰3、峰5（新綠原酸）、峰6、峰7、峰11（隱綠原酸）、峰12、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰21（川續(xù)斷皂苷乙）。朱香梅等[14]通過(guò)對(duì)山銀花種植資源、化學(xué)成分進(jìn)行成分歸納總結(jié)后，預(yù)測(cè)山銀花中的質(zhì)量標(biāo)志物為綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、木犀草苷等，部分預(yù)測(cè)指標(biāo)與本研究結(jié)果相同。后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這10種成分的變化，并對(duì)未定量成分建立定量分析方法，以便科學(xué)評(píng)價(jià)山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，15批山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的相對(duì)峰面積RSD值在18.80%～123.73%范圍內(nèi)，表明不同批次的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指紋峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分組成比例差異較大，尤其峰2的相對(duì)峰面積RSD值最大，可能是由于該色譜峰峰面積較小，易受周圍雜質(zhì)峰的影響，從而導(dǎo)致不同批次間峰面積積分差異較大。

3.3 Q-Orbitrap MS/MS分析 本試驗(yàn)采用Q-Orbitrap MS/MS技術(shù)對(duì)山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的共有指紋峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。由于山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的化合物主要為酚酸類，具有較多的羥基，可形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，因此多數(shù)化合物在負(fù)離子模式下色譜峰的響應(yīng)更好。21個(gè)共有指紋峰鑒定了18種化合物，有8種化合物已采用對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn)，但是還有峰4、峰7、峰13在現(xiàn)有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未匹配到相對(duì)應(yīng)的化合物，有待進(jìn)一步研究。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山銀花藥材中還含有黃酮類成分，如紫云英苷[15]、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷[16]、山奈酚-3-O-蕓香糖苷[17]、木犀草素[18]等；環(huán)烯醚萜類成分，如開(kāi)聯(lián)番木鱉苷[19]、裂環(huán)馬錢酸等；皂苷類成分，如α-常春藤皂苷元[20]、灰氈毛忍冬皂苷丙[20]、灰氈毛忍冬皂苷甲[21]等。上述成分在山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中尚未檢測(cè)到，可能是由于此類成分在山銀花藥材中含量和極性較低，在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中轉(zhuǎn)移率低，因此標(biāo)準(zhǔn)湯劑中基本無(wú)響應(yīng)。

3.4 含量測(cè)定分析 本研究基于山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，對(duì)其中6種質(zhì)量標(biāo)志物及2種采用對(duì)照品確認(rèn)的共有成分進(jìn)行定量測(cè)定。8個(gè)含量測(cè)定指標(biāo)中包括酚酸類成分6個(gè)，皂苷類成分2個(gè)。研究結(jié)果顯示不同批次的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分含量差異較大，尤其是酚酸類成分。文獻(xiàn)報(bào)道花蕾型灰氈毛忍冬黃白期灰氈毛忍冬皂苷乙顯著降低[22]，三青期的綠原酸含量最高，其次為大白、二白期，銀花、金花期綠原酸含量最低[23]，不同產(chǎn)地的山銀花花蕾中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的含量也存在較大差異[24]，因此不同批次的山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分含量可能與地域因素、采收時(shí)間等有關(guān)。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[25]，山銀花藥材中灰氈毛忍冬皂苷的含量最高，其次為綠原酸和異綠原酸A。而本研究結(jié)果也顯示山銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中灰氈毛忍冬皂苷的含量最高，為（155.99±22.57）mg/g；其次為綠原酸（88.51±11.77）mg/g和異綠原酸A（35.99±12.69）mg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，表明這些極性較大的成分從藥材到標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率良好，可以用于標(biāo)化、表征水提物的一致性。