唐 凌，陳 莉，張 聰

（1.樂山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 樂山 614000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 614000）

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥，也是全球癌癥死亡的第二大常見原因[1]。手術(shù)治療是早期肝癌的有效治療手段，但大部分患者確診時(shí)已是中晚期，故化療一直是肝癌首選的臨床治療方法。然而化療藥物的組織特異性差[2]，若發(fā)生肝癌細(xì)胞耐藥則會(huì)限制其治療效果，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)移且預(yù)后不良[3]。因此積極探索肝癌化療耐藥的分子機(jī)制以尋找更有效的治療靶點(diǎn)，對改善肝癌預(yù)后具有重要意義。Notch信號(hào)通路是一種高度保守的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞間接觸、細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及多種生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Notch1通路已被證明是多種癌癥中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4-5]，提示該通路可能與肝癌細(xì)胞化療耐藥進(jìn)展相關(guān)。蒼術(shù)酮是一種從中藥蒼術(shù)、白術(shù)中分離出的倍半萜類化合物，具有多種藥理活性[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)其可通過降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，但關(guān)于其是否可介導(dǎo)Notch1通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的化療敏感性尚待探究。故本研究擬體外培養(yǎng)人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu，使用蒼術(shù)酮干預(yù)，觀察細(xì)胞存活、凋亡、侵襲情況，并檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子表達(dá)水平，以期為肝癌化療耐藥干預(yù)靶點(diǎn)及藥物選擇提供一定的參考。

1 材 料

1.1 細(xì)胞系 人肝癌氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞株Bel/Fu購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 試劑 蒼術(shù)酮（純度≥98%）（批號(hào)：PCS1052）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；5-氟尿嘧啶（批號(hào)：2352C062）購自上海艾研生物科技有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)：C1062L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠（批號(hào)：356234）購自上海碩嘉生物科技有限公司；Invitrogen TRIzol試劑（批號(hào)：1382737）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BCA試劑盒（批號(hào)：20190325）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ECL發(fā)光液（批號(hào)：70120200）購自biosharp生物科技公司；P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）（批號(hào)：6970-100）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multiple resistance protein-1，MRP1）（批號(hào)：CAU32198）均購自武漢艾美捷科技有限公司；Notch1抗體（批號(hào)：ab167441）、Hes1抗體（批號(hào)：ab71559）、Jagged1抗體（批號(hào)：ab7771）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）抗體（批號(hào)：ab182858）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（批號(hào)：ab32503）抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 Gentier 96E實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（西安天隆科技有限公司）；MultiskanTMFC多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）復(fù)蘇細(xì)胞，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度環(huán)境條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d換液1次，細(xì)胞密度增至85%以上時(shí)進(jìn)行傳代，傳代2～3次。

2.2 CCK8法檢測不同濃度蒼術(shù)酮對Bel/Fu細(xì)胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化并離心，收集細(xì)胞沉淀，并分為對照組、4 μmol/L蒼術(shù)酮組、8 μmol/L蒼術(shù)酮組、16 μmol/L蒼術(shù)酮組、32 μmol/L蒼術(shù)酮組、64 μmol/L蒼術(shù)酮組。其中對照組培養(yǎng)液為RPMI 1640完全培養(yǎng)液，各濃度蒼術(shù)酮組培養(yǎng)液分別為RPMI 1640完全培養(yǎng)液+（4、8、16、32、64 μmol/L）蒼術(shù)酮。利用對應(yīng)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種100μL至96孔板（1×104個(gè)/孔），每個(gè)濃度各5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h。后于各孔內(nèi)直接加入10 μL CCK8試劑，孵育2 h后利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（OD）值，細(xì)胞存活率（%）=蒼術(shù)酮作用組OD值/對照組OD值×100%。重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞分組與培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的Bel/Fu細(xì)胞，胰酶消化并離心，收集細(xì)胞沉淀，分為空白組、5-氟尿嘧啶組、蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組，其中空白組培養(yǎng)液為RPMI 1640完全培養(yǎng)液，5-氟尿嘧啶組、蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加5-氟尿嘧啶（20 μmol/L）、蒼術(shù)酮（32 μmol/L）、5-氟尿嘧啶（20 μmol/L）+蒼術(shù)酮（32 μmol/L）。

2.4 CCK8法檢測各組細(xì)胞存活率 利用對應(yīng)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種100 μL至96孔板（1×104個(gè)/孔），每個(gè)濃度各5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h。后于各孔內(nèi)直接加入10 μL CCK8試劑，孵育2 h后利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（OD）值，細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值×100%。此處實(shí)驗(yàn)組分別為5-氟尿嘧啶組、蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組。重復(fù)3次，鏡下觀察并拍照記錄各組細(xì)胞形態(tài)。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 對應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后1 000 r/min離心5 min，取細(xì)胞沉淀，70%乙醇4 ℃固定過夜。離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，結(jié)合緩沖液重懸，Annexin V-FITC溶液和PI溶液避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次。

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 事先涂布Matrigel基質(zhì)膠于Transwell 24孔板上室，并于每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，下室加入500 μL各組對應(yīng)培養(yǎng)液（去除胎牛血清），48 h后，100%甲醇固定Transwell下側(cè)侵入細(xì)胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，鏡下觀察并拍照、計(jì)數(shù)。重復(fù)3次。

2.7 RT-qPCR技術(shù)檢測P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達(dá)量 各組對應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，檢測RNA完整性及純度，合格后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行定量檢測，反應(yīng)條件為94 ℃30s，60℃30 s，72 ℃1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。以β-actin為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對表達(dá)量。引物序列：P -gp：F:5' -TGATTGCATTTGGAGGACAA -3'，R：5' -CCAGAAGGCCAGAG CATAAG-3'；MRP1：F：5'-AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3'，R：5'-CCTGTGATCCACCAGAAGGT-3'；βactin：F：5'-CATGGAGTCCTGTGGCATC-3'，R：5'-CAGGGCAG TGATCTCCTTCT-3'。重復(fù)3次。

2.8 Western blotting法檢測通路、凋亡及化療耐藥相關(guān)蛋白相對表達(dá)情況 各組對應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，預(yù)冷RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞全蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加熱變性蛋白，SDS-PAGE電泳凝膠分離蛋白，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，1×TBST洗膜3次，后于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（1∶1 000稀釋）內(nèi)4 ℃孵育過夜；次日，1×TBST洗膜3次，二抗（1∶10 000稀釋）內(nèi)室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)曝光，Image J分析條帶灰度值，以目的蛋白P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、Bax與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié) 果

3.1 不同濃度蒼術(shù)酮處理下各組細(xì)胞存活率比較 細(xì)胞存活率隨蒼術(shù)酮濃度增大而降低（P<0.05）。當(dāng)蒼術(shù)酮作用濃度為32 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率接近50%。故選擇32 μmol/L蒼術(shù)酮進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（見圖1）

圖1 不同濃度蒼術(shù)酮處理下各組細(xì)胞存活率比較（±s，n=3）

3.2 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)48 h后，鏡下可見空白組細(xì)胞密度較大，呈梭形或卵圓形，排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整；5-氟尿嘧啶組細(xì)胞大部分呈長梭，結(jié)構(gòu)完整，僅見少量死亡細(xì)胞；蒼術(shù)酮組細(xì)胞密度小，細(xì)胞變大、形狀不一，呈扁平貼壁狀；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，見大量細(xì)胞空泡化、壞死，核濃縮或崩解。（見圖2）

圖2 光鏡下各組細(xì)胞形態(tài)圖（×100）

3.3 各組細(xì)胞存活率比較 5-氟尿嘧啶組細(xì)胞存活率與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.05）；與蒼術(shù)酮組比較，聯(lián)合組細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.05）。（見表2）

表2 各組細(xì)胞存活率比較 （±s）

表2 各組細(xì)胞存活率比較 （±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術(shù)酮組比較，cP<0.05

組別 n 細(xì)胞存活率（%）空白組 3 100.00±0.00 5-氟尿嘧啶組 3 97.70±1.97蒼術(shù)酮組 3 53.57±3.02a b聯(lián)合組 3 42.73±2.63a b c F 528.539 P 0.000

3.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 5-氟尿嘧啶組細(xì)胞凋亡率與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與蒼術(shù)酮組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。（見圖3、表3）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術(shù)酮組比較，cP<0.05

組別 n 細(xì)胞凋亡率（%）空白組 3 2.19±0.25 5-氟尿嘧啶組 3 2.81±0.33蒼術(shù)酮組 3 25.40±1.94a b聯(lián)合組 3 37.75±2.13a b c F 435.231 P 0.000

3.5 各組細(xì)胞侵襲情況比較 5-氟尿嘧啶組細(xì)胞侵襲數(shù)量與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低（P<0.05）；與蒼術(shù)酮組比較，聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低（P<0.05）。（見圖4、表4）

圖4 各組細(xì)胞侵襲情況（×400）

表4 各組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較 （±s）

表4 各組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術(shù)酮組比較，cP<0.05

組別 n 細(xì)胞侵襲數(shù)（個(gè)）空白組 3 201.33±15.82 5-氟尿嘧啶組 3 189.67±11.02蒼術(shù)酮組 3 101.33±12.90a b聯(lián)合組 3 61.33±11.02a b c F 84.315 P 0.000

3.6 各組Bel/Fu細(xì)胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達(dá)量比較 5-氟尿嘧啶組細(xì)胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達(dá)量與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組細(xì)胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低（P<0.05）；與蒼術(shù)酮組比較，聯(lián)合組細(xì)胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。（見表5）

表5 各組細(xì)胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA 相對表達(dá)量比較（±s）

表5 各組細(xì)胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA 相對表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術(shù)酮組比較，cP<0.05

組別 n P-gp mRNA MRP1 mRNA空白組 3 1.00±0.02 1.00±0.01 5-氟尿嘧啶組 3 0.95±0.03 0.97±0.03蒼術(shù)酮組 3 0.71±0.04a b 0.67±0.06a b聯(lián)合組 3 0.37±0.03a b c 0.42±0.05a b c F 261.342 126.930 P 0.000 0.000

3.7 各組細(xì)胞Notch1通路、凋亡及化療耐藥相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 5-氟尿嘧啶組細(xì)胞中P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術(shù)酮組及聯(lián)合組細(xì)胞P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均明顯降低，Bax蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；與蒼術(shù)酮組比較，聯(lián)合組細(xì)胞P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低，Bax蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。（見圖5、表6）

表6 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s，n=3）

表6 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s，n=3）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術(shù)酮組比較，cP<0.05

組別 P-gp MRP1 Notch1 Hes1 Jagged1 Bcl-2 Bax空白組 0.67±0.05 0.71±0.07 0.24±0.03 0.38±0.04 0.63±0.07 0.43±0.05 0.23±0.02 5-氟尿嘧啶組 0.58±0.06 0.63±0.06 0.21±0.04 0.35±0.05 0.59±0.06 0.41±0.04 0.22±0.03蒼術(shù)酮組 0.29±0.04a b 0.20±0.03a b 0.15±0.02a b 0.26±0.02a b 0.28±0.03a b 0.24±0.01a b 0.34±0.02a b聯(lián)合組 0.08±0.01a b c 0.12±0.01a b c 0.10±0.01a b c 0.14±0.02a b c 0.17±0.01a b c 0.18±0.01a b c 0.64±0.04a b c F 112.667 112.211 15.600 28.469 65.295 42.884 139.727 P 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)Western blotting 圖

4 討 論

5-氟尿嘧啶是一種抗癌藥物，被用作肝癌治療的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物之一。其在高濃度下可獲得耐藥性和細(xì)胞毒性，致使其治療效果較弱[8]，故研究肝癌細(xì)胞耐藥性機(jī)制和治療策略以逆轉(zhuǎn)耐藥性和使癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶再敏感至關(guān)重要。中醫(yī)藥治療腫瘤療效確切，可抑制腫瘤生長、提高患者生存質(zhì)量、減輕臨床癥狀。據(jù)報(bào)道，中西醫(yī)聯(lián)合治療可減少西藥毒副作用、降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、延緩病情進(jìn)展，對防治腫瘤作用顯著[9-10]。蒼術(shù)酮為臨床常用抗腫瘤中藥白術(shù)的主要成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)酮具有一定的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)[11]，可抑制肝癌細(xì)胞HepG2活力和遷移，影響細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7,12]。本研究采用體外培養(yǎng)人肝癌氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞株Bel/Fu，并利用蒼術(shù)酮干預(yù)。結(jié)果顯示：細(xì)胞存活率呈劑量依賴性降低，提示蒼術(shù)酮可抑制肝癌細(xì)胞化療耐藥株細(xì)胞增殖；另經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用后，與5-氟脲嘧啶組比較，聯(lián)合組細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，且鏡下細(xì)胞形態(tài)變形，結(jié)構(gòu)可見有損傷，說明蒼術(shù)酮可增強(qiáng)5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

多藥耐藥是腫瘤化療失敗的最常見原因，耐藥性與ATP結(jié)合盒蛋白家族藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)有關(guān)，包括多藥耐藥性1基因及其編碼產(chǎn)物P-gp、MRP等[13]。P-gp是一種跨膜蛋白，可將藥物排出體外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的生物利用度，從而降低藥物抗癌的功效。P-gp可保護(hù)耐藥細(xì)胞免受自由基、輻射和細(xì)胞毒藥物誘導(dǎo)的各種形式的半胱天冬酶依賴性細(xì)胞凋亡的影響，延緩細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在分子水平上建立腫瘤抗性和細(xì)胞凋亡耐受性之間的有機(jī)聯(lián)系[14]。MRP1也稱為ABCC1，為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員。其表達(dá)下調(diào)可逆轉(zhuǎn)化療耐壓癌細(xì)胞的耐藥性[15]，MRP1MRP1/ABCC1的過表達(dá)預(yù)示著SCLC對化療的不良反應(yīng)[16]。SUN Z等[17]研究表明，P-gp可促進(jìn)耐多藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞系多藥耐藥發(fā)展。ZHOU Y等[18]研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1/順鉑中P-gp、MRP1蛋白相對表達(dá)量顯著高于SK-Hep1。LI S等[19]研究顯示，P-gp和MRP1的表達(dá)抑制可增加由丙型肝炎病毒感染的人類肝癌Huh7.5.1細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。本研究結(jié)果顯示，與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術(shù)酮單獨(dú)作用、蒼術(shù)酮聯(lián)合5-氟尿嘧啶作用Bel/Fu細(xì)胞后，細(xì)胞中P-gp、MRP1的mRNA和蛋白相對表達(dá)量均降低，且聯(lián)合應(yīng)用后效果更顯著，提示蒼術(shù)酮可通過抑制耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)提高藥物在細(xì)胞內(nèi)的生物利用度及細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

肝癌細(xì)胞耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括識(shí)別和泵出腫瘤細(xì)胞抗癌藥物的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加、藥物在細(xì)胞內(nèi)積聚的重新分布、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的失活等[20]。到目前為止，HCC耐藥性的確切機(jī)制仍有待研究?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族的兩種代表性蛋白，Bax和Bcl-2在正常細(xì)胞中形成二聚體且表達(dá)相對穩(wěn)定。當(dāng)Bax表達(dá)增加而Bcl-2表達(dá)減少時(shí)，兩者之間平衡被打破，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。Notch1通路是一種細(xì)胞-細(xì)胞間的通信機(jī)制，由細(xì)胞膜結(jié)合的Notch受體與其配體（如Jagged1～2）在并列細(xì)胞上相互作用而激活。質(zhì)膜上釋放Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核，與CSL轉(zhuǎn)錄因子及共激活因子形成復(fù)合體可促進(jìn)Notch靶基因如Hes、Hey的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)節(jié)增殖、凋亡/生存中發(fā)揮重要作用[22]。ZHOU J等[23]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch1/Hes1信號(hào)通路可增強(qiáng)人胃癌細(xì)胞皮下異種移植模型對5-氟尿嘧啶的化學(xué)敏感性，此時(shí)Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡增加。LI N N等[24]研究表明，轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA可下調(diào)MRP1表達(dá)和活性。另有研究顯示，Notch1敲低可導(dǎo)致P-gp和MRP1表達(dá)水平降低，抑制人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并增加其體外對5-氟尿嘧啶的敏感性[25]。本研究結(jié)果顯示，蒼術(shù)酮單獨(dú)作用Bel/Fu時(shí)，可顯著降低Notch1、Hes1、Jagged1及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量并上調(diào)Bax蛋白相對表達(dá)量，且5-氟尿嘧啶聯(lián)合蒼術(shù)酮后，細(xì)胞內(nèi)Notch1、Hes1、Jagged1及Bcl-2蛋白相對蛋白相對表達(dá)量量下調(diào)或Bax表達(dá)上調(diào)更為顯著，提示蒼術(shù)酮可能通過抑制Notch1通路激活降低耐藥相關(guān)蛋白P-gp和MRP1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

綜上所述，蒼術(shù)酮可提高細(xì)胞凋亡率，降低細(xì)胞存活及侵襲能力，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性，其作用機(jī)制可能與抑制Notch1通路激活有關(guān)。