魏雯雯,李 敏,王玉風(fēng),房冬梅,侯學(xué)濤

(濟(jì)南市第二婦幼保健院婦科,濟(jì)南 271199)

宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)又稱(chēng)Asherman綜合征,是因妊娠或非妊娠子宮創(chuàng)傷引起的并發(fā)癥,導(dǎo)致宮腔部分或全部閉塞,從而導(dǎo)致月經(jīng)異常、不孕或反復(fù)流產(chǎn)等[1]。研究表明,HMGB1作為內(nèi)源性細(xì)胞因子可參與炎癥、血管新生等多種病理生理過(guò)程,在組織受損缺血狀況下,血清HMGB1表達(dá)升高[2]。同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí),用重組HMGB1可改善某些缺血性疾病結(jié)局[3]。血小板源性生長(zhǎng)因子-AA(platelet-derived growth factor AA,PDGF-AA)作為促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂、趨化的細(xì)胞因子,在細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解中起重要作用[4]。本研究通過(guò)免疫組化法測(cè)定宮腔粘連內(nèi)膜組織高遷移率組蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA(platelet-derived growth factor,PDGF-AA)的表達(dá),探討HMGB1、PDGF-AA在宮腔粘連發(fā)病中的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月1日至2021年12月31日在濟(jì)南市第二婦幼保健院婦科就診的宮腔粘連及繼發(fā)不孕行宮腔鏡診治術(shù)的患者,其中宮腔粘連組(輕、中、重度)48例,對(duì)照組(大致正常宮腔形態(tài))41例。納入標(biāo)準(zhǔn):宮腔粘連組:符合宮腔粘連診斷標(biāo)準(zhǔn)(按AFS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分度:1～4分為輕度,5～8分為中度,9～12分為重度),有生育要求者,宮腔鏡檢查在月經(jīng)干凈后3～7d內(nèi)實(shí)施,閉經(jīng)者隨時(shí)手術(shù)。對(duì)照組:繼發(fā)性不孕患者,經(jīng)宮腔鏡檢查確認(rèn)宮腔形態(tài)大致正常。排除標(biāo)準(zhǔn):不明原因陰道不規(guī)則流血;合并高血壓、糖尿病等內(nèi)科疾病;合并盆腔炎、婦科惡性腫瘤、結(jié)核等其他生殖系統(tǒng)疾病;存在血栓形成高危因素或有血栓性疾病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò),患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 取樣方法 宮腔鏡診治術(shù)中應(yīng)用微型鉗鉗取適量宮腔粘連組織周邊子宮內(nèi)膜組織,對(duì)照組鉗取適量子宮內(nèi)膜組織,經(jīng)生理鹽水沖洗后固定標(biāo)本。

1.3 主要試劑及器材 兔抗人單克隆抗體Anti-HMGB1[EPR 3507](ab79823)購(gòu)自Abcam公司,鼠抗人單克隆抗體PDGF-AA抗體(E-10)(sc-9974)購(gòu)自Santa公司,DAB染色液、酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物購(gòu)于上?；蚩萍脊煞萦邢薰?抗體稀釋液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。采用顯微鏡及多功能圖像分析工作站(OLYMPUS,BX61)進(jìn)行閱片及圖像收集。

1.4 免疫組化檢測(cè)HMGB1、PDGF-AA表達(dá) 組織樣本采用多聚甲醛固定24h、石蠟包埋、切片(厚2μm)、二甲苯脫蠟、水化,添加檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原,加3%過(guò)氧化氫靜置10min,除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;加兔抗HMGB1、鼠抗PDGF-AA孵育,加二抗-酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物30min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗,加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液;用蘇木精重染、透明、封片、閱片。

1.5 結(jié)果判定 HMGB1陽(yáng)性信號(hào)主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),PDGF-AA陽(yáng)性信號(hào)主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞漿;陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為目標(biāo)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀。免疫組化染色結(jié)果采用半定量分析計(jì)數(shù)系統(tǒng)[5],根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度綜合評(píng)分進(jìn)行結(jié)果判斷。2名高級(jí)職稱(chēng)(副主任醫(yī)師及以上)病理醫(yī)生采用雙盲法,獨(dú)立對(duì)切片進(jìn)行染色評(píng)估,在高倍鏡下(400×)隨機(jī)觀察三個(gè)視野。根據(jù)細(xì)胞染色程度:藍(lán)色、淡黃色、棕黃色、棕褐色,依次評(píng)為0、1、2、3分;根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):將陽(yáng)性細(xì)胞比值的0%～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、大于75%分別評(píng)為0、1、2、3、4分。將兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘后的分值作為每張切片的最終評(píng)分0～12分:0為陰性(-),1～3分為弱陽(yáng)性(+),4～8分為中等陽(yáng)性(++),9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。將免疫組化結(jié)果分為兩組:低表達(dá)(-～+)和高表達(dá)(++～+++),其中以高表達(dá)之和計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般情況比較 兩組患者的年齡、孕產(chǎn)次比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般情況比較

2.2 HMGB1、PDGF-AA在宮腔粘連中的表達(dá) HMGB1陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為組織的細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒,HMGB1高表達(dá)率在宮腔粘連組為41.67%,在對(duì)照組為68.29%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PDGF-AA陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為組織的胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒,PDGF-AA高表達(dá)率在宮腔粘連組為70.83%,在對(duì)照組為36.59%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、表2。

圖1 宮腔粘連組與對(duì)照組HMGB1、PDGF-AA在宮腔組織中的表達(dá)(SP×400)

表2 兩組研究對(duì)象HMGB1、PDGF-AA高表達(dá)率比較[n(%)]

2.3 HMGB1、PDGF-AA陽(yáng)性表達(dá)與宮腔粘連程度的關(guān)系 宮腔粘連組織中,HMGB1表達(dá)與宮腔粘連程度呈負(fù)相關(guān),粘連程度越高,HMGB1表達(dá)越低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.4 相關(guān)性分析 Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果表明,宮腔粘連中HMGB1和PDGF-AA蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.294,P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 宮腔粘連中HMGB1、PDGF-AA蛋白表達(dá)的相關(guān)性(n)

3 討 論

宮腔粘連主要與子宮內(nèi)膜基底層損傷有關(guān),是子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)障礙最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。目前臨床上存在各種治療方法,但都未能徹底解決子宮內(nèi)膜受損、生育力下降問(wèn)題[6-7]。近年來(lái)關(guān)于病因的研究重點(diǎn)放在創(chuàng)傷和纖維細(xì)胞增殖活性學(xué)說(shuō)上。有學(xué)者認(rèn)為子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)和脫落是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程,子宮內(nèi)膜基底層損傷可引起內(nèi)膜血液循環(huán)不足、子宮動(dòng)脈閉塞甚至纖維化,導(dǎo)致組織缺氧,內(nèi)膜上皮細(xì)胞再生障礙,最終造成胞外基質(zhì)過(guò)度沉積、成纖維細(xì)胞增殖,引起宮腔粘連[8-9]。因此,創(chuàng)面組織中新生血管的生長(zhǎng)對(duì)改善創(chuàng)面微循環(huán)、減少感染、促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生等起著非常重要的作用,其形成障礙直接或間接引起宮腔粘連。探討血管形成、組織修復(fù)相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制,有助于為宮腔粘連治療提供新的思路和靶點(diǎn),對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)可能起到一定的輔助作用。

近期研究表明,HMGB1在血管形成、組織修復(fù)中起著不可替代的作用。HMGB1可通過(guò)多種途徑促進(jìn)血管生成:促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散、遷移、發(fā)芽,直接促進(jìn)血管形成[10-11];通過(guò)多種機(jī)制間接調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng),如HMGB1可通過(guò)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、募集,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子產(chǎn)生較強(qiáng)的促血管生成信號(hào),引起巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的激活,其中內(nèi)皮前體細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可分化為內(nèi)皮細(xì)胞并納入新生血管,這些都對(duì)血管生成起重要作用[8,12]。HMGB1可通過(guò)內(nèi)皮前體細(xì)胞的分化和募集誘導(dǎo)血管形成細(xì)胞,有助于血管網(wǎng)絡(luò)的形成[13]。本研究表明,HMGB1在正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于宮腔粘連組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與以上研究相符。

PDGF-AA是一種具有多生物學(xué)效應(yīng)的生長(zhǎng)因子,具有促進(jìn)纖維細(xì)胞分化增殖、調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等作用[14]。PDGF-AA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用失調(diào),導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖,從而促進(jìn)瘢痕形成[15]。本研究顯示,宮腔粘連組子宮內(nèi)膜組織中PDGF-AA表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PDGF-AA表達(dá)與IUA粘連程度呈正相關(guān),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因可能是子宮內(nèi)膜受到損傷后,在缺氧及應(yīng)激等各種作用下,激活血小板、炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等合成或釋放細(xì)胞內(nèi)蓄積的PDGF-AA,過(guò)度表達(dá)的PDGF-AA可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的形成和血管收縮作用,影響正常子宮內(nèi)膜修復(fù),并且由于炎性細(xì)胞對(duì)組織結(jié)構(gòu)的破壞,正常子宮內(nèi)膜逐漸被結(jié)締組織取代,最終導(dǎo)致宮腔粘連的形成。

綜上所述,HMGB1和PDGF-AA共同參與宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,有望成為監(jiān)測(cè)宮腔粘連進(jìn)展的潛在分子標(biāo)志物,也可為宮腔粘連的防治提供新的治療靶點(diǎn)。但本研究?jī)H在蛋白表達(dá)水平上探討了HMGB1、PDGF-AA與宮腔粘連的相互關(guān)系,其具體作用機(jī)制不明。后續(xù)需增加樣本量,進(jìn)一步深入研究宮腔粘連的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)而有助于對(duì)宮腔粘連高危婦女進(jìn)行分子靶向治療。