莫 蕊,陳燕娥,吳 穎,陳 綿

(?？谑袐D幼保健院婦產(chǎn)科,?？?570203)

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,病死率很高,早期不易確診,就診時多為晚期,此時主要依靠化療緩解腫瘤進展,但因癌細胞化療耐藥性的獲得,療效并不理想,且易復(fù)發(fā)。紫杉醇作為一種廣譜抗癌化學(xué)藥物,是晚期卵巢癌的治療首選,盡量減輕卵巢癌的紫杉醇耐藥性,可有效改善患者預(yù)后[1-3]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,其中缺失-小同源異形-2樣蛋白(Absent-Small-Homeotic-2-Like protein,ASH2L)在其中起到致癌作用,其高表達水平與腫瘤的惡性程度相關(guān),可促進胰腺腫瘤侵襲、增殖和血管生成[4]。CircASH2L還可介導(dǎo)卵巢癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后,敲除CircASH2L基因可抑制卵巢癌細胞的侵襲和生長,并抑制異種移植的血管和淋巴管生成,發(fā)揮抗癌作用[5],但CircASH2L在腫瘤的紫衫醇耐藥及卵巢癌發(fā)生發(fā)展中具有何種作用目前還沒有明確。

miR-128-3p是一種腫瘤抑制因子,上調(diào)其表達可在體外顯著抑制大腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡抵抗性,并在體內(nèi)阻礙實體腫瘤生長[6],還可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的活性、增殖、遷移、侵襲和多藥耐藥相關(guān)蛋白1(resistance-associated protein 1,MRP1)表達,恢復(fù)其對替莫唑胺的敏感性[7]。研究顯示,miR-128-3p在卵巢癌組織和細胞中表達減少,過表達miR-128-3p可顯著誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡,降低其細胞活力和遷移侵襲能力[8]。MAP激酶相互作用絲氨酸/蘇氨酸激酶2(MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2,MKNK2)作為一種重要的腫瘤調(diào)控因子,在化療耐藥卵巢癌細胞中表達顯著上調(diào),與耐藥卵巢癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān),敲除MKNK2基因可顯著降低卵巢癌細胞的化療耐藥性,抑制其增殖[9]。以上文獻提示miR-128-3p和MKNK2均是減弱卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性的潛在靶點。由生物信息學(xué)分析可知CircASH2L可能通過miR-128-3p調(diào)控MKNK2表達,因而預(yù)測CircASH2L可能通過調(diào)節(jié)miR-128-3p/MKNK2軸影響卵巢癌細胞的紫杉醇耐藥性,本文通過敲低體外培養(yǎng)的人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株SKOV3-TR30中CircASH2L表達,對此預(yù)測做驗證研討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人卵巢癌細胞株SKOV3、人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞SKOV3-TR30(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫研究所);含雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基(YC-1003S,上海語純);LipofectamineTM2000(invitrogen);野生型miR-128-3p報告質(zhì)粒、CircASH2L過表達質(zhì)粒、突變型miR-128-3p報告質(zhì)粒、野生型MKNK2 3'-UTR報告質(zhì)粒、突變型MKNK2 3'-UTR報告質(zhì)粒、miR-128-3p mimics、miR-128-3p mimics陰性對照、miR-128-3p inhibitor、miR-128-3p inhibitor陰性對照、CircASH2L siRNA質(zhì)粒、CircASH2L空載質(zhì)粒、miR-128-3p及CircASH2L、MKNK2、多重耐藥1(multidrug resistance 1,MDR1)、MRP5、β-actin、U6引物(上海吉瑪);紫杉醇、MTT試劑盒/細胞增殖檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶);一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒、Trizol試劑、Annexin V凋亡檢測試劑盒(上海生工);兔源抗人β-actin、MRP5、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、MKNK2一抗(美國Abcam公司)等。熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司;流式細胞儀購自美國BECKMAN COULTE公司;電泳儀電源、迷你雙垂直電泳槽、迷你雙垂直轉(zhuǎn)印電泳槽購自上海江美;化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自北京森西賽智科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測卵巢癌細胞中miR-128-3p與CircASH2L、MKNK2表達 解凍復(fù)蘇的SKOV3和SKOV3-TR30細胞,用RPMI 1640(含雙抗)細胞完全培養(yǎng)基(加10%胎牛血清)培養(yǎng),傳代后收集兩種細胞。Trizol試劑提取細胞中總RNA,采用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒進行PCR擴增實驗,具體方法和反應(yīng)條件參考說明書。miR-128-3p以U6為內(nèi)參,CircASH2L、MKNK2以β-actin為內(nèi)參。引物序列,miR-128-3p:F-5'-TGCGGCAGTGGTTTTACCCTATG-3',R-5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6:F-5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',R-5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3';CircASH2L:F-5'-GCTGGGCAGGAAAACCTATT-3',R-5'-TTTCCCAGGTCTCTGTCTGG-3';MKNK2:F-5'-TCATGCAAGCTTATGTGGAGCTGGAAG-3',R-5'-TTGATGCTAGATCAGCGGCGTTTGAGT-3';MDRl:F-5'-AAAAGATCAACTCGTAGGAGTG-3',R-5'-GCACAAAATACACCAACAA-3';MRP5:F-5'-GCTGTTCAGTGGCACTGTCAG-3',R-5'-TCAGCCCTTGACAGCGACCTT-3';β-actin:F-5'-CCGTACCACTGGCATCGTG-3',R-5'-GCCATCTCTTGCTCGAAG-3'。以2-ΔΔCt方法分析基因相對表達量。

1.2.2 SKOV3-TR30細胞分組處理及收集標(biāo)本 SKOV3-TR30細胞進行傳代后,接種在無菌24孔板培養(yǎng),24h后隨機分為對照組、紫杉醇組、紫杉醇+陰性對照組、紫杉醇+CircASH2L敲低組、紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor組。對照組不進行干預(yù)處理,紫杉醇組加20nmol/L紫杉醇處理[10],紫杉醇+陰性對照組加20nmol/L紫杉醇處理同時使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor陰性對照和空載質(zhì)粒(具體轉(zhuǎn)染步驟參考LipofectamineTM2000說明書),紫杉醇+CircASH2L敲低組加20nmol/L紫杉醇處理同時以同法轉(zhuǎn)染CircASH2L siRNA,紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor組細胞加20nmol/L紫杉醇處理同時以同法轉(zhuǎn)染CircASH2L siRNA和miR-128-3p inhibitor,各組都于轉(zhuǎn)染及藥物處理24h后收集細胞備用。

1.2.3 MTT實驗檢測細胞增殖情況 SKOV3-TR30細胞進行傳代后,按10000細胞/孔接種于無菌96孔板,24h后按1.2.2中方法分組處理,24h后每孔加適量MTT工作液急性培養(yǎng)4h,吸出上清,以二甲基亞砜溶解底部結(jié)晶,混勻后以酶標(biāo)儀測量每孔吸光值。細胞增殖率=實驗處理組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.2.4 流式細胞實驗檢測細胞凋亡情況 SKOV3-TR30細胞進行傳代后,接種在無菌24孔板培養(yǎng)24h,按1.2.2中方法分組處理,24h后以胰酶消化收集各組細胞后計數(shù),每組取約1×106個細胞,PBS洗滌,采用Annexin V凋亡檢測試劑盒通過FITC/PI雙染法檢測每組細胞凋亡情況,具體轉(zhuǎn)染步驟參考試劑盒說明書。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測細胞miR-128-3p與CircASH2L、MKNK2、MDR1、MRP5表達 收集各組細胞中總RNA,進行實時熒光定量PCR實驗,具體按1.2.1中方法進行。

1.2.6 免疫印跡實驗檢測細胞MKNK2、P-gp、MRP5表達 以高強度RIPA裂解液裂解提取各組細胞中總蛋白,以改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒測量其濃度,具體方法參考說明書。根據(jù)蛋白濃度測定結(jié)果每組取出20μg總蛋白進行變性、電泳分離、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移處理,以脫脂牛奶封閉其非特異位點后裁下各目的蛋白MKNK2、β-actin、P-gp、MRP5,孵育一抗、二抗后顯色,采集顯色后蛋白條帶圖像,以Image J軟件定量各蛋白灰度值后進行統(tǒng)計分析,以β-actin作為內(nèi)參,得到其相對表達。

1.2.7 檢測MKN-45細胞中CircASH2L對miR-128-3p及miR-128-3p對MKNK2的靶向調(diào)控 SKOV3-TR30細胞進行傳代后,接種在無菌24孔板中培養(yǎng)24h,隨機分為miR-128-3p突變+CircASH2L空載組(轉(zhuǎn)染突變型miR-128-3p報告質(zhì)粒+空載質(zhì)粒)、miR-128-3p突變+CircASH2L過表達組(轉(zhuǎn)染突變型miR-128-3p報告質(zhì)粒+CircASH2L過表達質(zhì)粒)、miR-128-3p野生+CircASH2L空載組(轉(zhuǎn)染野生型miR-128-3p報告質(zhì)粒+空載質(zhì)粒)、miR-128-3p野生+CircASH2L過表達組(轉(zhuǎn)染野生型miR-128-3p報告質(zhì)粒+CircASH2L過表達質(zhì)粒)、MKNK2突變+miR-128-3p mimics陰性對照組(轉(zhuǎn)染突變型MKNK2 3'-UTR報告質(zhì)粒+miR-128-3p mimics陰性對照)、MKNK2突變+miR-128-3p mimics組(轉(zhuǎn)染突變型MKNK2 3'-UTR報告質(zhì)粒+miR-128-3p mimics)、MKNK2野生+miR-128-3p mimics陰性對照組(轉(zhuǎn)染野生型MKNK2 3'-UTR報告質(zhì)粒+miR-128-3p mimics陰性對照)、MKNK2野生+miR-128-3p mimics組(轉(zhuǎn)染野生型MKNK2 3'-UTR報告質(zhì)粒+miR-128-3p mimics),按1.2.2中方法進行轉(zhuǎn)染,24h后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測量各組細胞雙熒光素酶相對活性,具體方法參考試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1 CircASH2L、miR-128-3p、MKNK2在卵巢癌細胞中的表達 與SKOV3細胞相比,SKOV3-TR30細胞中CircASH2L與MKNK2 mRNA表達升高,miR-128-3p表達降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 各組細胞miR-128-3p與CircASH2L、MKNK2 mRNA表達

2.2 SKOV3-TR30細胞中CircASH2L對miR-128-3p的靶向調(diào)節(jié)及miR-128-3p對MKNK2的靶向調(diào)節(jié) 查詢數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)CircASH2L和miR-128-3p之間有結(jié)合位點,見圖2。與miR-128-3p野生+CircASH2L空載組比較,miR-128-3p野生+CircASH2L過表達組相對熒光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);miR-128-3p突變+CircASH2L空載組與miR-128-3p突變+CircASH2L過表達組之間相對熒光素酶活性無明顯差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

圖2 miR-128-3p和MKNK2、CircASH2L的結(jié)合位點

圖3 各組SKOV3-TR30細胞相對熒光素酶活性值比較

miR-128-3p和MKNK2之間有結(jié)合位點,見圖2。與MKNK2野生+miR-128-3p mimics陰性對照組比較,MKNK2野生+miR-128-3p mimics組相對熒光素酶活性降低(P<0.05);MKNK2突變+miR-128-3p mimics陰性對照組與MKNK2突變+miR-128-3p mimics組之間相對熒光素酶活性無明顯差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

圖4 各組SKOV3-TR30細胞相對熒光素酶活性值比較

2.3 各組細胞增殖率比較 與對照組、紫杉醇組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低組的細胞增殖率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與紫杉醇+CircASH2L敲低組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor組的細胞增殖率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

圖5 各組細胞增殖率比較

2.4 各組細胞凋亡率比較 與對照組、紫杉醇組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低組的細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與紫杉醇+CircASH2L敲低組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor組的細胞凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

圖6 各組細胞凋亡率比較

2.5 各組細胞miR-128-3p與CircASH2L、MKNK2、MDR1、MRP5 mRNA表達 與對照組、紫杉醇組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低組細胞CircASH2L、MKNK2、MDR1、MRP5 mRNA表達降低,miR-128-3p表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與紫杉醇+CircASH2L敲低組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor組細胞CircASH2L mRNA表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),MKNK2、MDR1、MRP5 mRNA表達升高,miR-128-3p表達降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

圖7 各組細胞miR-128-3p及CircASH2L、MKNK2、MDR1、MRP5 mRNA水平比較

2.6 Western blot法檢測細胞中MKNK2與耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP5表達 與對照組、紫杉醇組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低組細胞MKNK2、P-gp、MRP5蛋白表達降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與紫杉醇+CircASH2L敲低組相比,紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor組細胞MKNK2、P-gp、MRP5蛋白表達升高(P<0.05),見圖8。

圖8 各組細胞MKNK2、P-gp、MRP5蛋白相對表達水平比較

3 討 論

化療是晚期卵巢癌患者的主要治療手段,紫杉醇作為順鉑之后的新一代抗癌藥,在卵巢癌臨床治療中得到廣泛應(yīng)用,但耐藥性的產(chǎn)生極大減弱了其療效。盡量減輕卵巢癌的紫杉醇耐藥性已成為臨床腫瘤研究的重點[3,11-12]。CircASH2L可調(diào)控細胞周期、生長、凋亡、遷移和侵襲,敲除CircASH2L基因可觸發(fā)細胞周期阻滯,抑制成纖維細胞樣滑膜細胞增殖、遷移和侵襲,并促進其凋亡[13]。CircASH2L作為一種環(huán)狀RNA還具有明顯致癌活性,能增強胰腺癌和卵巢癌的增殖、侵襲、血管生成和體內(nèi)成瘤性,延緩兩種腫瘤的惡性進展[4-5]。本研究結(jié)果顯示,相比卵巢癌細胞株SKOV3,其紫杉醇耐藥細胞株SKOV3-TR30中CircASH2L表達升高,表明CircASH2L介導(dǎo)卵巢癌細胞紫杉醇耐藥過程,以20nmol/L紫杉醇處理SKOV3-TR30細胞,不影響其細胞增殖率及凋亡率,而以CircASH2L siRNA質(zhì)粒敲低SKOV3-TR30細胞中CircASH2L表達,可降低紫杉醇處理的SKOV3-TR30細胞中耐藥基因MDR1、MRP5 mRNA表達及其翻譯蛋白P-gp、MRP5表達,并降低細胞增殖率,升高其凋亡率。表明敲低CircASH2L表達可抑制SKOV3-TR30細胞耐藥性,增強紫杉醇對其的殺傷力,揭示CircASH2L可促進卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性產(chǎn)生,敲低其表達可增強其對紫杉醇的敏感性。

通過查詢Starbase數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析可推測CircASH2L可能通過下調(diào)miR-128-3p調(diào)控MKNK2表達。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實CircASH2L可靶向下調(diào)SKOV3-TR30細胞中miR-128-3p表達,miR-128-3p可靶向下調(diào)SKOV3-TR30細胞中MKNK2表達,且敲低SKOV3-TR30細胞CircASH2L可升高其miR-128-3p表達,降低MKNK2 mRNA及蛋白表達。表明CircASH2L可通過靶向下調(diào)miR-128-3p而增強MKNK2表達,從而促使卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性產(chǎn)生。miR-128-3p是具有抗癌活性的RNA分子,可抑制腫瘤耐藥產(chǎn)生,過表達miR-128-3p可抑制膠質(zhì)母細胞瘤生長并誘導(dǎo)其凋亡,增強其對替莫唑胺的敏感性[14]。miR-128-3p可減輕大腸癌化療耐藥性,增加其細胞內(nèi)奧沙利鉑的積累,在體內(nèi)外提升大腸癌的化療效果[15]。上調(diào)miR-128-3p可顯著抑制卵巢癌細胞增殖和遷移侵襲,并誘導(dǎo)其大量凋亡[8]。MKNK2是調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡和血管生成的蛋白激酶超家族成員,可介導(dǎo)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥性,抑制其表達可發(fā)揮顯著抗腫瘤作用,抑制膠質(zhì)母細胞瘤體內(nèi)增殖及前列腺癌細胞體外生長、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和進展[16-17],還能提高前列腺癌患者對恩扎魯胺的敏感性,減輕其耐藥性[18]。阻斷MKNK2信號可抑制黑色素瘤從增殖狀態(tài)到侵襲狀態(tài)的表型轉(zhuǎn)換,增強抗PD-1免疫療法敏感性[19],顯著減輕卵巢癌化療耐藥細胞的增殖活性和耐藥性[11]。本研究結(jié)果顯示,相比SKOV3細胞,SKOV3-TR30細胞中miR-128-3p表達降低,MKNK2 mRNA表達升高,表明miR-128-3p和MKNK2可介導(dǎo)卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生;敲低CircASH2L和miR-128-3p,相比僅敲低CircASH2L,紫杉醇處理的SKOV3-TR30細胞中MKNK2及MDR1、MRP5 mRNA表達升高,MKNK2及P-gp、MRP5蛋白表達升高,增殖率增加,凋亡率降低。表明下調(diào)miR-128-3p可減弱敲低CircASH2L對MKNK2及耐藥相關(guān)基因表達的降低作用,拮抗其對紫杉醇殺傷力的增強作用,最終逆轉(zhuǎn)敲低CircASH2L對卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性的抑制作用,揭示CircASH2L減弱卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性是通過上調(diào)miR-128-3p實現(xiàn)的。

綜上所述,CircASH2L在卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株SKOV3-TR30中高表達,并可通過靶向下調(diào)miR-128-3p而升高MKNK2表達,進而促進卵巢癌細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性,敲低CircASH2L可通過上調(diào)miR-128-3p而降低MKNK2表達,從而抑制卵巢癌細胞的紫杉醇耐藥性,增強紫杉醇對卵巢癌耐藥細胞的殺傷力。本文探索發(fā)現(xiàn)了調(diào)控卵巢癌細胞紫杉醇耐藥性的新型作用靶點和分子機制,有利于減輕卵巢癌臨床治療中的耐藥性,改進提升其化療療效。