常 晴,劉 佳,曲愛(ài)林,劉京康

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院a.檢驗(yàn)科;b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心;c.婦產(chǎn)科,濟(jì)南 250012)

子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近年來(lái)其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì),發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。早期診斷人群可通過(guò)手術(shù)取得較好的預(yù)后,5年生存率可達(dá)94.9%[2]。然而,晚期患者即使經(jīng)放射治療(放療)或化學(xué)治療(化療),術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍很高[3-4]。經(jīng)陰道超聲結(jié)合子宮內(nèi)膜組織活檢是診斷UCEC的主要方法,探索新的預(yù)后有關(guān)生物標(biāo)志物并與之聯(lián)合,將有助于提高UCEC的早期診斷率及制定合理的個(gè)體化治療方案。

近年來(lái),細(xì)胞焦亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用備受關(guān)注。焦亡是由炎癥介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡方式,其特征是細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、染色質(zhì)斷裂和促炎因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]。大量研究表明,惡性腫瘤中異常表達(dá)的焦亡基因可作為診斷、預(yù)后和靶向治療的分子標(biāo)志物[6-7]。Gao等[8]發(fā)現(xiàn),Gasdermin D(GSDMD)是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白,與正常組織相比,GSDMD在肺癌中高表達(dá),并且其表達(dá)水平與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn),焦亡相關(guān)的炎性小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)顯著高于正常組織,其通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-1表達(dá),增加HEC-1A細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。Wang等[10]報(bào)道,焦亡在腫瘤微環(huán)境中可觸發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),參與抗腫瘤免疫的調(diào)控。此外,細(xì)胞焦亡與化療藥物的應(yīng)用密切相關(guān),如5-氟尿嘧啶(5-FU)活化腫瘤細(xì)胞內(nèi)的caspase-3,激活GSDME-NT的生成,從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞焦亡[11]。以上研究表明,細(xì)胞焦亡在癌癥進(jìn)展中具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生和激活抗腫瘤免疫應(yīng)答的雙重作用。同時(shí),其對(duì)于化療、免疫治療等精準(zhǔn)醫(yī)療方案的實(shí)施可能具有一定指示作用。基于此,借助生物信息學(xué)方法,通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)庫(kù),挖掘UCEC焦亡相關(guān)基因,構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型,初步探究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者預(yù)后和免疫浸潤(rùn)的關(guān)系。同時(shí),將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與臨床病理參數(shù)進(jìn)行整合,構(gòu)建可視化的Nomogram模型,方便臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 從UCSC xena(https://xenabrowser.net/datapages/)中的TCGA-UCEC隊(duì)列下載子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)錄組RNA seq數(shù)據(jù)和生存信息,導(dǎo)入R軟件(版本4.0.2),將數(shù)據(jù)讀入并進(jìn)行歸一化處理。使用分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)(MSigDB)(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb)和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(PubMed號(hào):33828074和34992421)查找焦亡相關(guān)表型基因集,獲得22種焦亡基因納入后續(xù)分析。從cbioportal 數(shù)據(jù)庫(kù)(www.cbioportal.org)選擇癌癥類(lèi)型為子宮內(nèi)膜癌并點(diǎn)擊TCGA-PanCancer Atlas模塊,獲得509例具有突變信息的UCEC樣本,進(jìn)行后續(xù)分析。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org)獲得PPI互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 焦亡相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建 排除臨床數(shù)據(jù)和預(yù)后信息缺失的樣本,共納入533例有臨床病理信息和生存數(shù)據(jù)的UCEC樣本。其中,Ⅰ期331例,Ⅱ期50例,Ⅲ期123例,Ⅳ期29例。根據(jù)病灶部位及病情嚴(yán)重程度,排除沒(méi)有相關(guān)數(shù)據(jù)的樣本,最終分選出3種類(lèi)型的UCEC樣本,即11例原發(fā)型UCEC,37例復(fù)發(fā)型UCEC和34例轉(zhuǎn)移型UCEC。根據(jù)病理分級(jí)分為G1級(jí)109例、G2級(jí)117例和G3級(jí)307例。使用R包glmne進(jìn)行最小絕對(duì)收縮選擇算子(LASSO)回歸篩選焦亡相關(guān)預(yù)后基因,得出交叉驗(yàn)證誤差最小的模型。預(yù)測(cè)模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=Exp1*β1+ Exp2*β2+ Exp3*β3+…… +Expx*βx,其中Exp為相對(duì)應(yīng)預(yù)后的基因表達(dá)量,β為lasso回歸系數(shù)。使用R包“timeROC”構(gòu)建受試者工作曲線(ROC)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型預(yù)測(cè)能力的準(zhǔn)確性。將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床病理參數(shù)(年齡、病理分期)納入以構(gòu)建預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的Nomogram, 使用“cox.step”函數(shù)篩選出最佳變量組合用于建模。應(yīng)用C指數(shù)、受試者工作曲線(receiver operating character,ROC曲線)和校準(zhǔn)曲線分析法(calibration)對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)估。

1.2.2 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后和免疫浸潤(rùn)比較 將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值作為截?cái)嘀?把子宮內(nèi)膜癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組,使用 R軟件的survival 包和 survminer 包繪制 Kaplan-Meier 生存曲線,評(píng)估兩組患者的預(yù)后差異。基于TCGA-UCEC隊(duì)列中的RNA seq數(shù)據(jù),通過(guò)ssGSEA算法計(jì)算樣本的28種免疫細(xì)胞豐度,比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用R軟件(版本4.0.2)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。兩組間比較使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。生存曲線(Kaplan-Meier)使用log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA-UCEC隊(duì)列中22種焦亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組特征 根據(jù)MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,共獲得22種焦亡相關(guān)基因, TCGA-UCEC隊(duì)列中包含了533例子宮內(nèi)膜癌樣本和35例癌旁樣本,導(dǎo)入R軟件對(duì)22種焦亡相關(guān)基因mRNA進(jìn)行表達(dá)差異分析。結(jié)果顯示,13種基因在UCEC組織中的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05),3種基因在UCEC組織中的表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05),6種基因在癌與癌旁組織中表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1A。

為了明確22種焦亡相關(guān)基因的表達(dá)水平是否受到轉(zhuǎn)錄組突變的影響,通過(guò)cbioportal數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)22種基因進(jìn)行了突變分析。結(jié)果顯示,具有突變信息的509例子宮內(nèi)膜癌患者中有288例患者存在基因突變(57%),其中,TP53基因發(fā)生突變的樣本例數(shù)(194例)占總樣本(509例)的38%,在22種基因中突變頻率最高,突變類(lèi)型主要為錯(cuò)義突變(missense mutation)和截?cái)嗤蛔?truncating mutation),其次是CASP8基因,突變頻率為12%,提示焦亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組變異可能影響基因的表達(dá)水平(圖1B)。進(jìn)一步使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建22種焦亡相關(guān)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2),發(fā)現(xiàn)22種基因在蛋白質(zhì)水平上存在密切聯(lián)系。

圖1 TCGA-UCEC隊(duì)列中22種焦亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組特征

圖2 22種焦亡相關(guān)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 構(gòu)建預(yù)測(cè)UCEC預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型 對(duì)癌與癌旁組織有差異表達(dá)的16種焦亡基因進(jìn)行進(jìn)一步分析,篩選具有預(yù)后價(jià)值的相關(guān)基因。為了避免模型的過(guò)度擬合,通過(guò)LASSO回歸分析,基于lambda.min方法確定最佳lambda值為9(圖3A、B),共獲得9種與預(yù)后有關(guān)的焦亡基因(CASP3、CASP5、CYCS、GPX4、GZMB、IL1A、IRF2、TP53 和TNF)。計(jì)算每例UCEC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(-0.0169*CASP3表達(dá)量)+(0.7129* CASP5表達(dá)量)+(0.2239*CYCS表達(dá)量)+(-0.2027* GPX4表達(dá)量)+(-0.1743*GZMB表達(dá)量)+(-0.0185* IL1A表達(dá)量)+(-0.3798* IRF2表達(dá)量)+(-0.0752* TP53表達(dá)量)+(0.0631*TNF表達(dá)量)。

隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加,患者生存時(shí)間縮短,死亡人數(shù)明顯增多(圖3C、D)。提示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可能是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。通過(guò)時(shí)間依賴性ROC曲線評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型預(yù)測(cè)效能,ROC曲線的1、3、5年AUC值分別為0.627、0.722、0.770,表明該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)UCEC患者具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力(圖3E)。

圖3 LASSO回歸構(gòu)建UCEC預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)模型A:LASSO系數(shù)分布特征;B:選擇LASSO模型中最佳調(diào)整參數(shù) λ (lambda);C:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和總體生存期的分布特征;D:不同生存狀態(tài)下的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布特征(生存狀態(tài):0代表存活;生存狀態(tài):1:代表死亡);E:時(shí)間依賴性ROC曲線評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)后價(jià)值

2.3 高低風(fēng)險(xiǎn)組中臨床病理分型、預(yù)后特征和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比較 將UCEC患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值作為截?cái)嘀?將533例UCEC患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(261例)和低風(fēng)險(xiǎn)組(272例)。分析不同臨床病理分型在兩組間的分布特征,Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期UCEC樣本在高風(fēng)險(xiǎn)組中的比例高于低風(fēng)險(xiǎn)組,而Ⅰ期UCEC樣本在高風(fēng)險(xiǎn)組中的比例低于低風(fēng)險(xiǎn)組。原發(fā)型UCEC和轉(zhuǎn)移型UCEC在高風(fēng)險(xiǎn)組的比例低于低風(fēng)險(xiǎn)組,而復(fù)發(fā)型UCEC樣本在高風(fēng)險(xiǎn)組的占比高于低風(fēng)險(xiǎn)組。此外,對(duì)腫瘤細(xì)胞的分化程度進(jìn)行分級(jí),結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)組中G1級(jí)和G2級(jí)樣本占比高于高風(fēng)險(xiǎn)組,G3級(jí)在低風(fēng)險(xiǎn)組占比低于高風(fēng)險(xiǎn)組。見(jiàn)表1。Kaplan-Meier生存曲線顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組生存率存在顯著差異,低風(fēng)險(xiǎn)組患者總生存期顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.001),預(yù)后較好(圖4A)。

表1 不同臨床病理分型在高低風(fēng)險(xiǎn)組間的占比[n(%) ]

使用ssGSEA對(duì)兩組進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析,發(fā)現(xiàn)與高風(fēng)險(xiǎn)組相比,低風(fēng)險(xiǎn)組中激活型B細(xì)胞、激活型CD8+T細(xì)胞、激活型樹(shù)突狀細(xì)胞、CD56 bright NK細(xì)胞、CD56 dim NK細(xì)胞、中央記憶型CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶型CD8+T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、Ⅰ型輔助性T細(xì)胞和17型輔助性T細(xì)胞的免疫細(xì)胞亞群顯著上調(diào)(P<0.05),效應(yīng)記憶型CD4+T細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)組中的比例高于低風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.05),激活型CD4+T細(xì)胞、中央記憶型CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助型T細(xì)胞2在兩組中占比無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖4B。

圖4 高低風(fēng)險(xiǎn)組間預(yù)后特征和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)A:高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組間總體生存期比較;B:單樣本基因集富集分析比較高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

2.4 構(gòu)建Nomogram模型 通過(guò)逐步回歸方法確定納入Nomogram模型的最佳變量,最終確定風(fēng)險(xiǎn)程度、年齡和臨床病理分期3個(gè)變量構(gòu)建預(yù)后Nomogram(圖5A)。Nomogram預(yù)后模型的C指數(shù)(C-index)為0.681(95%CI為0.618～0.742,P<0.001),1、3、5年總體生存率ROC曲線的AUC值分別為0.625、0.701、0.762(圖5B),表明構(gòu)建的Nomogram預(yù)測(cè)模型具有較高的準(zhǔn)確性。預(yù)測(cè)1、3、5年總生存率的校準(zhǔn)曲線(calibration)同樣顯示Nomogram預(yù)后模型與實(shí)際觀測(cè)結(jié)果一致性較高,提示Nomogram的預(yù)測(cè)效能良好。見(jiàn)圖5C～E。

圖5 構(gòu)建UCEC患者預(yù)后Nomogram模型A:預(yù)測(cè)UCEC患者預(yù)后的Nomogram;B:時(shí)間依賴性ROC曲線驗(yàn)證Nomogram的預(yù)后價(jià)值;C～E:分別為Nomogram模型1年、3年、5年的校準(zhǔn)曲線

3 討 論

焦亡不僅導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而且會(huì)引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[12]。細(xì)胞壞死即可誘發(fā)大量炎性細(xì)胞因子的釋放,長(zhǎng)期暴露于炎性環(huán)境能增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]。本研究中,從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載533例UCEC樣本,通過(guò)比較焦亡基因在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平及進(jìn)行Lasso回歸分析,獲得了9個(gè)預(yù)后相關(guān)因子,繼而構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,并初步探究了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者預(yù)后和免疫浸潤(rùn)的關(guān)系,進(jìn)一步結(jié)合其他臨床病例參數(shù)構(gòu)建UCEC焦亡相關(guān)基因預(yù)后模型。

本研究從22個(gè)焦亡基因中篩選出反映UCEC患者預(yù)后的9個(gè)焦亡關(guān)鍵基因,包括CASP3、CASP5、CYCS、GPX4、GZMB、IL-1A、IRF2、TP53和TNF,其中大部分在其他研究中已有相關(guān)報(bào)道。如CASP3編碼的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào),且caspase-3陽(yáng)性表達(dá)患者的預(yù)后良好,5年生存率可達(dá)25%,而caspase-3陰性患者的5年生存率僅為6%[14]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4 (GPX4) 是一種保護(hù)脂質(zhì)過(guò)氧化的抗氧化酶,Kang等[15]發(fā)現(xiàn),其在免疫細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),可對(duì)抗GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。顆粒酶B (GzmB)是主要由自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì),GzmB通過(guò)直接裂解gasdermin 家族成員GSDME和激活caspase-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡,從而達(dá)到抗腫瘤作用[16]。Zhang 等[17]發(fā)現(xiàn),特異性敲除TP53會(huì)阻斷脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的焦亡。以上研究提示,這些焦亡相關(guān)基因可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。目前CYCS、IL-1A、IRF2在UCEC中的作用尚無(wú)有關(guān)報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn),其與UCEC的預(yù)后顯著相關(guān),推測(cè)這些分子可能是預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物。

以往研究發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)炎性小體在腫瘤細(xì)胞中廣泛分布,如NLRP1、NLRP3和CARD等,炎性小體可通過(guò)調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的焦亡[18]。細(xì)胞焦亡能導(dǎo)致炎癥小體活化及炎癥介質(zhì)釋放,后者可招募免疫細(xì)胞浸潤(rùn)并殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,具有抗腫瘤免疫反應(yīng)功能的CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、CD56 bright NK細(xì)胞、CD56 dim NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞亞群在低風(fēng)險(xiǎn)組上調(diào),提示低風(fēng)險(xiǎn)組免疫微環(huán)境表現(xiàn)為“熱腫瘤”,具有較高的免疫原性。同時(shí),預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型可在一定程度上反映免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況,并可能為免疫治療提供新的切入點(diǎn)。

Cao等[19]發(fā)現(xiàn)了與胃癌臨床病理特征、預(yù)后和免疫微環(huán)境浸潤(rùn)顯著相關(guān)的9個(gè)焦亡基因標(biāo)記,通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)方法確定了3種不同的焦亡基因亞型,患者免疫微環(huán)境狀態(tài)、免疫治療反應(yīng)和預(yù)后特征在3種亞型之間有顯著差異。在肺腺癌中,Liu等[20]構(gòu)建了與焦亡相關(guān)的3種lncRNAs的預(yù)后模型,此模型與患者的總生存期、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度及免疫治療反應(yīng)密切相關(guān)。本研究構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將UCEC樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組,結(jié)果顯示,低風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存期顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組,而高風(fēng)險(xiǎn)組表現(xiàn)出更差的臨床分期、病理分級(jí)和更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。為了方便臨床應(yīng)用,將此預(yù)后模型進(jìn)一步可視化為Nomogram,應(yīng)用ROC曲線和校準(zhǔn)預(yù)測(cè)曲線證實(shí)Nomogram具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)效能。

本研究基于TCGA大樣本多中心的數(shù)據(jù)構(gòu)建了Nomogram預(yù)后模型,確保了該模型的穩(wěn)定性,但仍存在一定局限性,如子宮內(nèi)膜癌相關(guān)臨床指標(biāo)(病理分期TNM及腫瘤標(biāo)志物CA125和CA199)未納入TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),因此無(wú)法評(píng)估以上臨床指標(biāo)對(duì)UCEC預(yù)后的影響。此外,焦亡相關(guān)基因?qū)CEC的預(yù)后價(jià)值及潛在調(diào)控作用尚需臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以佐證。