吳戈平，胡薏敏，謝 緯，2，劉 玉，2，陳 生，2△

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518000； 2 深圳市中醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518000

近年來，臨床上肺結(jié)節(jié)的檢出率不斷提高。《肺結(jié)節(jié)診治中國專家共識（2018 年版）》將肺結(jié)節(jié)定義為直徑≤3 cm 的孤立性或多發(fā)性的局灶性、類圓形腫塊，其中孤立性結(jié)節(jié)多被肺實(shí)質(zhì)包裹，不伴肺不張、肺門增大或胸腔積液［1］。中醫(yī)典籍無“肺結(jié)節(jié)”“肺癌”的病名記載，有研究者認(rèn)為本病應(yīng)從“肺積”［2］論治，亦有從“痰”［3］“窠囊”［4］“絡(luò)病”［5］論治本病者。陳生教授認(rèn)為，肺結(jié)節(jié)應(yīng)屬“肺積”范疇，病因目前仍未完全明了，大致認(rèn)為與外感因素、環(huán)境因素、職業(yè)因素、情志因素、飲食偏頗、宿有舊疾等相關(guān)。其病機(jī)是正氣虧損，陰陽失調(diào)，六淫之邪乘虛入肺，或他臟病變，日久犯肺，邪滯于肺，導(dǎo)致肺臟功能失調(diào)，肺氣阻郁，宣降失司，氣機(jī)不利，血行受阻，津液失于輸布，津聚為痰，痰凝氣滯，瘀阻脈絡(luò)，于是痰濕瘀毒膠結(jié)，日久形成肺部結(jié)節(jié)。

補(bǔ)肺活血膠囊（簡稱BFHX）由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂組成，具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎的功效，臨床可用于治療肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、重癥肺炎等疾病［6-7］。臨床治療方面，手術(shù)切除是治療惡性結(jié)節(jié)的首選方案，對于中低危結(jié)節(jié)仍以抗炎治療和隨訪為主，缺乏有效的干預(yù)措施。然而HU等［8］通過多區(qū)域外顯子組測序技術(shù)證實(shí)腫瘤演變是動態(tài)過程，可能隨著時間進(jìn)展而變化，這一發(fā)現(xiàn)充分說明肺結(jié)節(jié)全過程干預(yù)的有效性和必要性。中醫(yī)中藥可補(bǔ)充西醫(yī)的不足之處，抑制肺結(jié)節(jié)倍增時間、降低轉(zhuǎn)癌風(fēng)險，緩解患者的焦慮，且經(jīng)濟(jì)便捷，應(yīng)用前景廣闊。本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接技術(shù)探討B(tài)FHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有利于揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的治療或干預(yù)作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫本研究所需數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)址見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)址

1.2 BFHX活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)篩選通過TCMSP及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫，檢索BFHX 組成“黃芪”“赤芍”“補(bǔ)骨脂”的化學(xué)成分，TCMSP 按照口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18 設(shè)置參數(shù)，BATMAN-TCM中按照分?jǐn)?shù)截至值≥20 且校正后，P值=0.05，設(shè)置參數(shù)篩選潛在的具有較高活性成分的化合物。

1.3 肺結(jié)節(jié)靶點(diǎn)獲取在GeneCards、OMIM、CTD數(shù)據(jù)庫中以“Pulmonary nodule”作為關(guān)鍵詞對肺結(jié)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，對評分高的靶點(diǎn)進(jìn)行篩查，獲得肺結(jié)節(jié)已知的可靠靶點(diǎn)，并篩選其中屬人種的靶點(diǎn)，利用R 4.1.2語言將BFHX與肺結(jié)節(jié)的靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.4 BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析利用STRING 11.5 在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI），設(shè)置可信度＞0.99，將所獲得的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件中，通過CytoNCA插件，以Degree 值為篩選條件，選擇大于中位數(shù)的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的核心靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物成分-核心靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶點(diǎn)基因功能富集和通路富集分析通過R 4.1.2 語言的Bioconductor 軟件包對BFHX干預(yù)肺結(jié)節(jié)的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 與KEGG 分析，GO生物分析通過生物途徑（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）進(jìn)行說明與注釋。

1.6 藥物成分-核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證利用分子對接模擬軟件Autodock Vina 1.1.2 對黃芪-赤芍-補(bǔ)骨脂主要活性成分與肺結(jié)節(jié)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取黃芪-赤芍-補(bǔ)骨脂主要活性成分的2D結(jié)構(gòu)，并利用Chem-Office 軟件進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。通過UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫查找肺結(jié)節(jié)核心靶點(diǎn)的蛋白ID，并在PDB 數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，以PDB格式保存。利用Pymol 軟件去除水分子及小分子配體。用AutoDockTools 1.5.7 軟件對蛋白受體加氫，并將受體和配體的文件轉(zhuǎn)換為PDBQT 格式。用vina 進(jìn)行分子對接，找到蛋白受體和小分子配體和結(jié)合位點(diǎn)并計算該位點(diǎn)下的結(jié)合能（自由能）。結(jié)合能越低，配體與受體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，分子與靶點(diǎn)蛋白作用越突出。

2 結(jié)果

2.1 BFHX 中活性成分與對應(yīng)靶點(diǎn)在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（截至2021年11月）和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（截至2021年11月）中篩選得到BFHX有效成分52個。

2.2 潛在作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果各數(shù)據(jù)庫收集的疾病靶點(diǎn)個數(shù)。詳見表2。與Uniprot 數(shù)據(jù)庫核對后，刪去未經(jīng)驗(yàn)證的，最終獲得肺結(jié)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)7499 個。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)經(jīng)Venn 圖取交集后共獲得潛在靶點(diǎn)230個，見圖1。構(gòu)建“方藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖2。拓?fù)浞治霰砻?，BFHX中等鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、β-谷甾醇、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、7-O-甲基異丙胺醇等成分作用的靶點(diǎn)最多，是BFHX干預(yù)肺結(jié)節(jié)的主要成分。

表2 各數(shù)據(jù)庫收集的疾病靶點(diǎn)

圖1 BFHX與肺結(jié)節(jié)交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 方藥-成分-靶點(diǎn)

2.3 PPl 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果將“2.2”項(xiàng)下的潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，以置信度（combined score＞0.95）為標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3A，該網(wǎng)絡(luò)包含156 個靶點(diǎn)和822 條對應(yīng)關(guān)系，平均度（Degree）值10.53，最大值為68。靶點(diǎn)的度值越大，與其相連的靶點(diǎn)越多，在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中越重要。應(yīng)用CytoNCA 插件，相關(guān)參數(shù)均為默認(rèn)，識別到PPI 網(wǎng)絡(luò)的2 個子模塊見圖3B，并得出前10 個關(guān)鍵靶點(diǎn)。見表3，圖3。

表3 BFHX干預(yù)肺結(jié)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖3 A PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 B 核心靶點(diǎn)篩選

2.4 GO富集分析結(jié)果從DAVID數(shù)據(jù)庫得到GO富集分析（P＜0.05）條目共2645 個，其中生物過程2305個，分子功能252個，細(xì)胞組分88個，對Q值排序后取前10名進(jìn)行分析見圖4。BFHX干預(yù)肺結(jié)節(jié)的潛在靶點(diǎn)主要參與CC 的有鉀離子通道蛋白復(fù)合體、膜筏、膜微區(qū)等；參與MF 的包括配體-活化轉(zhuǎn)錄因子活性、電壓-門控鉀通道活性、脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等；參與的主要BP 包括對脂多糖的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)等，表明BFHX可以通過多種途徑干預(yù)肺結(jié)節(jié)。

圖4 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析結(jié)果用R軟件對共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號通路富集，得到KEGG 通路（P＜0.05）168 條，閾值設(shè)置Q＜0.05，排序后取前30 名進(jìn)行分析，見圖5。KEGG富集最顯著的15條通路分別是主要包括脂質(zhì)相關(guān)通路、癌癥相關(guān)通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、化學(xué)致癌-受體激活、炎癥及感染性疾病相關(guān)通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等。結(jié)果顯示，BFHX可能通過抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌水平、抑制炎性反應(yīng)、神經(jīng)通路調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)通路調(diào)節(jié)等方式干預(yù)肺結(jié)節(jié)。

圖5 KEGG富集分析

2.6 藥物成分-核心靶點(diǎn)分子對接分析選取BFHX 有效活性成分度值前5 的關(guān)鍵藥效物質(zhì)與BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)最關(guān)鍵的3 個靶點(diǎn)蛋白AKT1、JUN、TP53進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。對接結(jié)果如表4所示，結(jié)合性最強(qiáng)的化合物-靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白和化合物三維結(jié)構(gòu)對接圖見圖6—8。BFHX中的關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能均值為-8.03 kcal/mol，提示這些活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合性較強(qiáng)，其中槲皮素與靶點(diǎn)對接活性最好。

圖6 核心靶點(diǎn)蛋白AKT1與化合物三維結(jié)構(gòu)對接圖

表4 BFHX活性成分-核心靶點(diǎn)分子對接

圖7 核心靶點(diǎn)蛋白JUN與化合物三維結(jié)構(gòu)對接圖

圖8 核心靶點(diǎn)蛋白TP53與化合物三維結(jié)構(gòu)對接圖

3 討論

3.1 肺結(jié)節(jié)與肺癌間的關(guān)系有研究認(rèn)為，磨玻璃結(jié)節(jié)樣肺癌不同于以往對早期肺癌的認(rèn)識，是1 種特殊亞型［9］，相關(guān)針對49 例患者磨玻璃結(jié)節(jié)的組織病理學(xué)研究顯示，肺結(jié)節(jié)肺腺癌的組織學(xué)譜有很強(qiáng)的相關(guān)性［10-11］，磨玻璃影的肺惡性結(jié)節(jié)受持續(xù)的激活突變影響，通過免疫逃逸并激活微環(huán)境以促進(jìn)血管生成、侵襲、上皮-間充質(zhì)改變，最終進(jìn)展為晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤［12］。然而肺結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷高度依賴影像學(xué)，并且部分實(shí)性結(jié)節(jié)的磨玻璃成分和實(shí)性成分在影像學(xué)表現(xiàn)與病理學(xué)測量上并無特異性［13］，因此對存在判斷風(fēng)險的肺結(jié)節(jié)進(jìn)行手術(shù)切除，會使患者經(jīng)受非必要的手術(shù)及并發(fā)癥影響［14］。多組學(xué)分析表征顯示表現(xiàn)為磨玻璃影的惡性肺結(jié)節(jié)具有較低的突變負(fù)擔(dān)、較低的活性免疫環(huán)境和較少的ctDNA脫落，這可能是其惰性臨床病程的機(jī)制［15］。低級別亞型結(jié)節(jié)與早期肺腺癌間的異質(zhì)性研究可能會揭示這些結(jié)節(jié)中抗腫瘤免疫和免疫逃逸之間的生物張力，并推動部分腫瘤的后續(xù)進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移［12，16］。

3.2 BFHX 成分分析BFHX 膠囊由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂組成。方中黃芪具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、改善化療藥物耐藥等作用［17-18］；赤芍對肺動脈高壓、心血管系統(tǒng)疾病有良好的治療效果［19］，可有效抑制癌細(xì)胞增殖［20］、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［21］、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲［22］；補(bǔ)骨脂中的多種化合物具有抗腫瘤、抗癌細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化［23-26］的作用。本研究借助數(shù)據(jù)庫獲得BFHX 活性成分52個，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示的關(guān)鍵化合物包括7-O-甲基異丙胺醇、異補(bǔ)骨脂素、刺芒丙花素、山柰酚、槲皮素等。槲皮素是一種具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用的黃酮醇類化合物［27］。WANG 等［28］研究表明，槲皮素通過調(diào)節(jié)miR-16-5p 和WEE1 表達(dá)來增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性。在肺腺癌中槲皮素能夠抑制PI3K/Akt 信號通路的激活，增強(qiáng)癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［29］。異補(bǔ)骨脂素是一種呋喃香豆素類化合物，是中藥補(bǔ)骨脂的重要活性成分之一［30］，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用［31-32］，可抑制LncRNA THOR 的表達(dá)［33］。LncRNA THOR 是一種內(nèi)源性RNA分子，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Lnc-THOR 通過與IGF2BP1 結(jié)合加速非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，表明Lnc-THOR 可能是治療非小細(xì)胞肺癌的一種新型靶點(diǎn)［34］。山柰酚是一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗菌等多種功效［35-36］，它可通過抑制miR21的表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的增殖［37］。miR-21 是一種多效性miRNA，miR-21的過表達(dá)可以誘導(dǎo)AKT 的活化從而影響病理性肺重塑［38］，miR-21 的敲除也可抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成［39］。刺芒柄花素是中藥黃芪中分離出的一種具有生物活性的化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗癌等作用［40］，刺芒柄花素可以通過抑制NSCLC 中的EGFR-Akt-Mcl-1軸來抑制腫瘤生長［41］，其機(jī)制是Bax蛋白受到刺激后激活caspase3表達(dá)，抑制AKT表達(dá)，誘導(dǎo)Mcl-1 下調(diào)，而刺芒柄花素具有良好的體內(nèi)耐受性［42］，可能是一種潛在的抗腫瘤化合物。

3.3 BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的潛在機(jī)制核心靶點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵作用，我們依據(jù)degree 值篩選出最關(guān)鍵的3個靶點(diǎn)，Jun、AKT1、FOS。Jun原癌基因（c-Jun）、Fos 原癌基因（c-Fos）組成的AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物通過上調(diào)下游靶基因參與了惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程，在腫瘤的進(jìn)展與逆轉(zhuǎn)中起關(guān)鍵作用［43］，尤其與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。c-Jun 通過參與細(xì)胞有絲分裂在細(xì)胞增殖和致癌轉(zhuǎn)化中起到重要功能，也是第一種被發(fā)現(xiàn)的純致癌轉(zhuǎn)錄因子，c-Fos 涉及細(xì)胞的關(guān)鍵功能，包括分化、增殖、生存及受缺氧和血管生成影響的組織穩(wěn)態(tài)［44-45］。SCHREIBER等［46］發(fā)現(xiàn)c-Jun通過負(fù)調(diào)控其啟動因子活性抑制TP53的表達(dá)，TP53的負(fù)調(diào)控可能有助于c-Jun促進(jìn)致癌轉(zhuǎn)化的能力。劉曉麗等［47］通過發(fā)現(xiàn)c-Jun在Ⅲ～Ⅳ期肺癌組織中陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于Ⅰ～Ⅱ期，表明c-Jun與肺癌組織的惡性程度密切相關(guān)。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-specific protein kinase，AKT）的主要亞型，主要參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡進(jìn)程，在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中表現(xiàn)出過度活化。研究顯示磨玻璃結(jié)節(jié)的AKT 酶顯著高于正常對照組織，考慮其可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)增加共同起到誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的作用［48-50］，亦有研究顯示，在Ⅰ型胰島素樣生長因子受體（insulinlike growth factor Ⅰ receptor，IGF-IR）誘導(dǎo)肺腫瘤模型的小鼠體內(nèi)AKT 水平明顯升高且肺腫瘤表現(xiàn)為單個或多個散在結(jié)節(jié)［51］，猜測BFHX可能通過抑制AKT1干預(yù)肺結(jié)節(jié)。

3.4 BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的潛在通路通過KEGG 富集分析，我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路與肺結(jié)節(jié)的發(fā)生密切相關(guān)。一項(xiàng)針對良惡性肺結(jié)節(jié)患者的血漿代謝組學(xué)分析顯示，與良性肺結(jié)節(jié)患者相比，惡性肺結(jié)節(jié)患者血漿中的氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和膽固醇代謝受到嚴(yán)重干擾。與健康組相比，良惡性肺結(jié)節(jié)患者的血漿代謝物檢測到共同的代謝特征，這提示良惡性肺結(jié)節(jié)有相同的變化趨勢［52］。脂質(zhì)代謝異常會導(dǎo)致局部脂質(zhì)堆積，對細(xì)胞膜的生物物理性質(zhì)產(chǎn)生影響［53］，而磷脂參與維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器完整，良惡性肺結(jié)節(jié)患者血漿磷脂水平下降可能提示磷脂保護(hù)作用下降，細(xì)胞生物膜和脂質(zhì)雙分子層遭到破壞。這也與GO 分析發(fā)現(xiàn)BFHX 干預(yù)肺結(jié)節(jié)的主要靶點(diǎn)集中在細(xì)胞膜、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物上的結(jié)論不謀而合。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對技術(shù)探討補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)肺結(jié)節(jié)的潛在機(jī)制，將中醫(yī)整體、辨證思維模式與現(xiàn)代藥理研究方法結(jié)合起來，構(gòu)建了體現(xiàn)中醫(yī)藥特點(diǎn)的研究方法。闡明了補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)肺結(jié)節(jié)的可能活性成分及靶標(biāo)蛋白質(zhì)的生物功能，通過模擬關(guān)鍵藥效物質(zhì)-靶標(biāo)蛋白的相互作用揭露了補(bǔ)肺活血膠囊的作用機(jī)制。結(jié)果表明鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、β-谷甾醇等物質(zhì)可能通過調(diào)控Jun、AKT1、FOS 等靶點(diǎn)蛋白，對脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17、TNF 等信號通路進(jìn)行干預(yù)，發(fā)揮抗腫瘤、抗癌細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化等作用，為深入研究補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)肺結(jié)節(jié)的活性成分及機(jī)制提供了堅實(shí)的科學(xué)理論基礎(chǔ)。