萬(wàn)麗麗, 王轉(zhuǎn)茸, 湯 謐, 張學(xué)軍, 任 儉, 曾紅霞, 張 娜, 孫玉宏, 朱志坤

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖北武漢 430065; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南三亞農(nóng)作物育種試驗(yàn)中心,海南三亞 572014; 4.湖北省武漢市蔡甸區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,湖北武漢 430199)

甜瓜是葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物,果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,是一種色、香、味俱佳的重要水果。甜瓜的類型品種非常豐富,根據(jù)植物學(xué)、生態(tài)學(xué)、農(nóng)業(yè)生物學(xué)特征特性,將甜瓜分為兩大類,即厚皮甜瓜和薄皮甜瓜。隨著栽培技術(shù)、生長(zhǎng)環(huán)境以及農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)市場(chǎng)的變化,現(xiàn)代園藝作物育種目標(biāo)除了豐產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)、早熟性狀的要求更具體化,又提出了更多新的目標(biāo)如可觀賞性、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化以及與農(nóng)業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈配套相結(jié)合等。種質(zhì)資源是新品種選育的基礎(chǔ),目前種質(zhì)資源創(chuàng)新的主要途徑有3個(gè),一是利用育種過程中產(chǎn)生的新品系及種質(zhì)材料;二是利用天然突變或者誘變育種獲得新育種材料;三是利用全基因組及泛基因組測(cè)序、來源不同種質(zhì)資源的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)分析、重要性狀遺傳群體構(gòu)建及目標(biāo)基因精細(xì)定位等獲得有育種價(jià)值的基因資源,進(jìn)而利用分子標(biāo)記技術(shù)、基因工程技術(shù)如轉(zhuǎn)基因、基因編輯技術(shù)等創(chuàng)制豐富的種質(zhì)資源[1-2]。

植物的遺傳轉(zhuǎn)化是通過將生物體基因組中所需的目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體中,通過科學(xué)技術(shù)方法將其轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)并成功表達(dá),定向改變?cè)牧线z傳性狀并獲得穩(wěn)定遺傳表型的新品種的過程[3]。常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有直接轉(zhuǎn)化法[包括聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法、電穿孔法、超聲波法、基因槍法]、花粉管通道法和細(xì)胞轉(zhuǎn)化法等。第二載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng),主要包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。目前最常用的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,包括含有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中,Ti(Ri)質(zhì)粒上的一段可轉(zhuǎn)移的DNA(T-DNA)會(huì)隨機(jī)插入植物基因組中,在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化后表達(dá)使得植物再生。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用最為廣泛,適用于幾乎所有的雙子葉和單子葉植物。該方法具有轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、多以單拷貝或者低拷貝形式整合到植物基因組、基因沉默發(fā)生概率低等優(yōu)勢(shì)。目前已經(jīng)在水稻、玉米、小麥、大豆、番茄等主要農(nóng)作物中成功應(yīng)用[4-5]。在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究中,離體再生是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的前提,目前以子葉為外植體進(jìn)行離體再生是最為成熟的方法,器官直接再生途徑對(duì)甜瓜具有普適性從而奠定了遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)[6]。然而目前甜瓜遺傳體系不完善,轉(zhuǎn)化再生植株陽(yáng)性率低。為了提高轉(zhuǎn)化再生效率,研究者從2個(gè)關(guān)鍵因素入手開展研究。一方面是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化率。不同葫蘆科作物基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性存在差異,比如在西瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中,EHA105的最高轉(zhuǎn)化效率為0.92%,GV3101的轉(zhuǎn)化效率為0.88%,LBA4404轉(zhuǎn)化率為0%[7]。農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和活力對(duì)浸染效率影響較大,-80 ℃儲(chǔ)存的農(nóng)桿菌需要進(jìn)行1～2次活化,達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)活力最強(qiáng)。轉(zhuǎn)化方法同樣是提高轉(zhuǎn)化效率的核心,利用再生能力強(qiáng)的細(xì)胞與農(nóng)桿菌充分接觸,采用納米刷、超聲波和真空滲透處理等方式可以減小農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞的阻力[8]。另一方面是提高轉(zhuǎn)化后細(xì)胞誘導(dǎo)胚再生能力。近年來,研究者通過超表達(dá)發(fā)育調(diào)控因子(DRs)可以極大地提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[9-13]。在西瓜中超表達(dá)擬南芥AtGRF5、嵌合基因TaGRF4-OsGIF1和ZmWUS-ZmBBM能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化再生植株陽(yáng)性率[7]。利用西瓜內(nèi)源嵌合基因ClGRF4-GIF1可以將西瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率提高9倍,突變ClGRF4內(nèi)部的miR396的靶向位點(diǎn)能夠?qū)⑦z傳轉(zhuǎn)化效率提高到67.2%[14]。除了激素誘導(dǎo)芽再生,植物組織受傷也能夠促進(jìn)器官發(fā)生,AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子WOUNDINDUCEDDEDIFFERENTIATION1(WIND1)能夠促使受傷位點(diǎn)的細(xì)胞脫分化并誘導(dǎo)愈傷組織形成,超表達(dá)WIND1以及同源基因WIND2-4能使得愈傷組織在無(wú)外源施加激素下繼續(xù)生長(zhǎng)[15-16]。此外,AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子PLT3、PLT5和PLT7參與機(jī)械損傷后維管組織的修復(fù)和再生,主要是通過與CUC2基因啟動(dòng)子直接結(jié)合后上調(diào)其表達(dá),提高內(nèi)源生長(zhǎng)素含量從而促進(jìn)維管組織再生[17]。

本研究以5種不同基因型厚皮甜瓜和4種不同基因型薄皮甜瓜為材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉外植體轉(zhuǎn)化方法,從而篩選最優(yōu)誘導(dǎo)芽再生培養(yǎng)基激素組合,適用于甜瓜的Basta除草劑濃度,促進(jìn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜子葉的浸染方法以及超表達(dá)不同發(fā)育調(diào)控基因(AtGRF5、AtWUS、AtPLT5、AtWIND1)對(duì)甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化再生及轉(zhuǎn)化效率等方面的研究,建立穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系,為甜瓜的基因功能鑒定及生物技術(shù)育種提供有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 本試驗(yàn)所用厚皮甜瓜材料為都蜜5號(hào)(A1)、玉菇(A2)、雪蜜(A3)、檸檬蜜(A4)、虹玉(A5),21C-1自交系(C1),21C-2自交系(C2),薄皮甜瓜材料為美濃(B1)、綠寶(B2)、武農(nóng)青玉(B3)、羊角蜜(B4),121自交系(D1),LB自交系(D2)。其中自交系種質(zhì)在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院武湖試驗(yàn)基地繁殖。

1.1.2 遺傳轉(zhuǎn)化載體和菌株 植物表達(dá)載體pV16B和PFGC5941載體圖譜如圖1所示。試驗(yàn)所使用的大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)為DH10B,農(nóng)桿菌感受態(tài)為EH105。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)育調(diào)控基因的擴(kuò)增 從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到AtGRF5(AT3G13960)、AtWUS(At2g17950)、AtPLT5(At5g57390)和AtWIND1(At1g78080)的編碼序列(CDS),參考ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit (C112,Vazyme Biotech Co.,Ltd,南京) 引物設(shè)計(jì)方法(表1),由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:擬南芥cDNA 2 μL(50 ng/μL)、上游引物2 μL(50 μmol/L)、下游引物2 μL(10 μmol/L),2×Phanta Max Buffer 25 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,用ddH2O定容至50 μL?；靹蛏鲜鯬CR反應(yīng)體系后按照如下程序擴(kuò)增,反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將正確的目標(biāo)條帶回收。

表1 DRs類表達(dá)載體構(gòu)建相關(guān)引物

1.2.2 重組載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BamH Ⅰ對(duì)PFGC5941質(zhì)粒進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系:

PFGC5941質(zhì)粒 1 μg、NcoⅠ內(nèi)切酶 0.7 μL(10 U)、BamHⅠ內(nèi)切酶 0.7 μL(10 U)、10×Reaction Buffer 5 μL,用ddH2O定容至50 μL。37 ℃酶切3～4 h后膠回收。將“1.2.1”節(jié)中的目標(biāo)片段與線性化PFGC5941載體通過同源重組連接,具體步驟參考ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit詳細(xì)說明,37 ℃ 30 min后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,過夜培養(yǎng)篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定陽(yáng)性重組子并送武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化載體 植物表達(dá)載體pV16B,包含植物抗性選擇標(biāo)記Bar(圖1-A)。以PFGC5941載體為骨架,利用NcoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)將AtGRF5(AT3G13960)、AtWUS(At2g17950)、AtPLT5(At5g57390)和AtWIND1(At1g78080)的CDS導(dǎo)入,所得的植物雙元表達(dá)載體命名為AtGRF5、AtWUS、AtPLT5、AtWIND1(圖1-B),轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

1.2.4 菌液制備及侵染 取5 μL 重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105,28 ℃培養(yǎng)2 d,挑取單克隆于5 mL含有50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL 利福平的液體LB培養(yǎng)基中,28 ℃搖菌(200 r/min)培養(yǎng)14～16 h。之后吸取200 μL菌液于裝有20 mL液體LB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中,28 ℃搖菌(200 r/min)培養(yǎng)12～16 h。

1.2.5 不同濃度Basta除草劑篩選 取未浸染農(nóng)桿菌的子葉外植體接種在3種濃度(2、5、10 mg/L) Basta除草劑的SIM培養(yǎng)基上篩選,培養(yǎng)環(huán)境為 25～26 ℃,7～14 d繼代1次,4周后觀察再生,考察外植體褐化數(shù)量。根據(jù)外植體褐化死亡的數(shù)量確定合適的篩選濃度。

1.2.6 在不同濃度激素組合培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽分化試驗(yàn) 為了確定適合于不同甜瓜材料子葉外植體不定芽誘導(dǎo)再生的激素組合,本試驗(yàn)參考黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中激素組合6-BA和ABA[8],設(shè)置3個(gè)不同濃度組合(0.5 mg/L 6-BA+1 mg/L ABA,1 mg/L 6-BA+1 mg/L ABA,2 mg/L 6-BA+1 mg/L ABA),用于篩選獲得誘導(dǎo)不定芽的激素組合。計(jì)算再生外植體比例=(能產(chǎn)生再生芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%。

1.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)培養(yǎng)基種類 發(fā)芽培養(yǎng)基(germination medium,GM)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉8 g/L),0.5 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA,pH值為5.85。農(nóng)桿菌浸染培養(yǎng)基(inoculation medium,IM)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L),0.5 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA,1.25 mmol/L嗎啉乙磺酸(MES),pH值為5.70,高溫滅菌后,加入200 mmol/L 乙酰丁香酮(AS)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基(co-cultivation medium,COM)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉8 g/L),0.5 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA,1.25 mmol/L MES,250 μmol/L硫辛酸(LA),pH值為5.70,高溫滅菌后,加入 200 mmol/L 乙酰丁香酮AS。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(shoot induction medium,SIM)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉8 g/L),根據(jù)不同基因型材料子葉外植體在 6-BA和ABA激素組合上不定芽再生率確定合適的濃度,pH值調(diào)節(jié)為5.85,高溫滅菌后,加入200 mg/L Timentin抑菌劑和2 mg/L AgNO3。生根培養(yǎng)基(root induction medium,RIM)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉 8 g/L),pH值為5.85,高溫滅菌后,加入200 mg/L Timentin抑菌劑和2 mg/L AgNO3。

1.2.8 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉外植體的遺傳轉(zhuǎn)化 (1)子葉外植體準(zhǔn)備。挑選飽滿甜瓜種子,溫湯浸種2～3 h,剝除種殼,用75%乙醇消毒1 min,1.5%次氯酸鈉處理10～15 min,無(wú)菌ddH2O沖洗3次,8～10 min/次。種子消毒后置于GM培養(yǎng)基上,28 ℃ 暗培養(yǎng)48 h,觀察種子露白后將子葉橫切成兩半,保留近胚根端的一半,將胚根從胚上掰除,使得胚上出現(xiàn)“U”形缺口,此時(shí)的胚用于農(nóng)桿菌浸染試驗(yàn)。(2)浸染農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備。農(nóng)桿菌EHA105包含植物雙元表達(dá)載體pV16B(包含植物抗性選擇標(biāo)記Bar和GFP表達(dá)組件)。在LB(含50 mg/L卡那霉素和 25 mg/L 利福平)固體平板上劃線,28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取單克隆接種于YEB(含有50 mg/L 卡那霉素和 25 mg/L 利福平)液體培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h至D600 nm為0.5～0.6。5 000 r/min 離心收集菌體,用IM培養(yǎng)基重懸收集菌體,調(diào)節(jié)至D600 nm為0.3～0.4備用。(3)農(nóng)桿菌浸染方法。用納米刷(KITA,Nanotek Brush)對(duì)外植體近“U”形口區(qū)域一個(gè)方向輕刷表面4～5次以保證胚的表面出現(xiàn)微傷口,之后置于含有農(nóng)桿菌懸浮液的三角瓶中。將外植體置于超聲波儀器(KQ-100DV)中10 s,之后轉(zhuǎn)移到真空干燥箱中,分別在-0.3、-0.5、-1.0 kPa壓力下處理90 s。上述試驗(yàn)結(jié)束后將外植體置于無(wú)菌濾紙上吸干多余菌液,轉(zhuǎn)移到鋪上1層濾紙的COM培養(yǎng)基上,其中外植體背面朝下與濾紙直接接觸。在26 ℃條件下暗培養(yǎng)72 h。(4)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。將共培養(yǎng)結(jié)束后的外植體用含有200 mg/L Timentin抑菌劑的無(wú)菌水漂洗3次,用無(wú)菌濾紙吸干表面水分,轉(zhuǎn)移到SIM培養(yǎng)基(含合適濃度的Basta)中,其中“U”形口端插入培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3 d后在熒光顯微鏡下觀察外植體表面是否有熒光,培養(yǎng)14 d后繼代培養(yǎng),直到再生芽出現(xiàn)在熒光顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)化GFP外植體陽(yáng)性率=(GFP熒光外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù))×100%;轉(zhuǎn)化GFP再生植株比例=(能再生GFP陽(yáng)性芽的外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù))×100%。(5)生根培養(yǎng)。將有GFP熒光芽的外植體轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中,直至根系正常發(fā)育后移至營(yíng)養(yǎng)缽成苗。上述遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所實(shí)驗(yàn)室完成,一個(gè)完整的試驗(yàn)周期大約需要3個(gè)月。

1.2.9 DRs類表達(dá)載體轉(zhuǎn)化甜瓜外植體再生率以及陽(yáng)性率分析 將DRs類表達(dá)載體(如圖1-B)轉(zhuǎn)化甜瓜A1、A2、B1、B2的外植體,在0.3 mg/L 6-BA 和Basta篩選劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),統(tǒng)計(jì)能夠再生芽的外植體數(shù)量。根據(jù)DRs載體上Bar基因設(shè)計(jì)引物BarF:5′-ATCGAGACAAGCACGGTCAA-3′、BarR:5′-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAA-3′,檢測(cè)再生芽轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性率。再生芽外植體比例=(能再生芽的外植體數(shù)量/接種外植體總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和Duncan’s 多重比較分析不同處理之間的差異,差異顯著性水平為α=0.01或者α=0.001,所有的統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 26.0中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜子葉外植體對(duì)Basta篩選劑的耐受性分析

將厚皮甜瓜A1～A5,薄皮甜瓜B1～B4在施加2、5、10 mg/L Basta除草劑的MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)4周后開始統(tǒng)計(jì)外植體褐化死亡數(shù)量。如圖2可見,大多數(shù)厚皮甜瓜和薄皮甜瓜外植體在2 mg/L Basta培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)6周,但是第8周會(huì)開始褐化死亡。在 5 mg/L Basta培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4周后外植體變黃色并于6周褐化死亡,死亡率在80%以上,在10 mg/L Basta培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4周外植體全部褐化死亡。因此選擇5 mg/L Basta作為遺傳轉(zhuǎn)化的篩選濃度。

2.2 不同濃度激素組合甜瓜不定芽誘導(dǎo)再生分析

甜瓜子葉外植體置于3種不同濃度激素組合的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分別為0.5 mg/L 6-BA和 1 mg/L ABA (簡(jiǎn)稱T1),1 mg/L 6-BA和 1 mg/L ABA (簡(jiǎn)稱T2),2 mg/L 6-BA和 1 mg/L ABA(簡(jiǎn)稱T3)。1周后“U”形口區(qū)域開始膨大,14 d后產(chǎn)生不定芽(圖3-A)。統(tǒng)計(jì)14 d后能夠再生長(zhǎng)度≥1 cm 不定芽的外植體比例,不同基因型甜瓜子葉在T2和T3培養(yǎng)基中誘導(dǎo)≥1 cm長(zhǎng)度不定芽的再生頻率極顯著地高于T1培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率。但是隨著6-BA濃度從1 mg/L提高至2 mg/L,在大多數(shù)材料子葉外植體的“U”形口區(qū)域會(huì)產(chǎn)生大量芽叢或者類似于芽的結(jié)構(gòu),而正常葉形且長(zhǎng)度≥1 cm芽的數(shù)量相比T1培養(yǎng)基再生芽的數(shù)量有所減少(圖3-B)。

2.3 不同真空滲透壓下轉(zhuǎn)化效率和再生效率分析

為了提高農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化外植體的效率,本試驗(yàn)對(duì)A1～A5、B1～B4甜瓜子葉用納米刷處理后置于含有pV16B的農(nóng)桿菌菌液中超聲波處理10 s,之后分別置于-0.3、-0.5、-1.0 kPa壓力的真空滲透儀器中處理90 s,共培養(yǎng)3 d后,轉(zhuǎn)移到SIM培養(yǎng)基培養(yǎng)4～5 d,在熒光顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)有GFP熒光的外植體數(shù)量并計(jì)算轉(zhuǎn)化率(圖4-A)。繼續(xù)培養(yǎng)6周后統(tǒng)計(jì)外植體的存活率以及含有GFP熒光的不定芽數(shù)量并計(jì)算轉(zhuǎn)化GFP再生芽的比例。結(jié)果顯示,上述甜瓜子葉外植體在-1.0 kpa真空滲透壓下轉(zhuǎn)化率最高(圖4-B),3種真空滲透壓作用下甜瓜子葉外植體的存活率沒有顯著差異(圖4-C)。經(jīng)過在SIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周,統(tǒng)計(jì)具有GFP熒光的不定芽數(shù)量,結(jié)果顯示,在-1.0 kPa真空滲透壓處理后轉(zhuǎn)化pV16B外植體具有GFP熒光的不定芽數(shù)量極顯著(P<0.001)高于-0.3 kPa和 -0.5 kPa 真空滲透壓處理(圖4-D)。

2.4 在甜瓜中超表達(dá)不同類型DRs表達(dá)載體統(tǒng)計(jì)再生出芽外植體的比例

選擇優(yōu)良厚皮甜瓜種質(zhì)C1、C2和薄皮甜瓜種質(zhì)D1、D2分別轉(zhuǎn)化CON(未含有DR表達(dá)組件對(duì)照載體)、AtGRF5、AtWUS、AtPLT5和AtWIND1遺傳轉(zhuǎn)化載體,之后將子葉外植體轉(zhuǎn)移到低濃度6-BA (0.03 mg/L)和5 mg/L Basta培養(yǎng)基上培養(yǎng),4周后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)(圖5-A),計(jì)算具有再生能力外植體比例。結(jié)果顯示,在低濃度細(xì)胞分裂素以及Basta篩選劑作用下,在C1和D2種質(zhì)中4種DRs元件的外植體再生出芽能力極顯著高于不含有DRs表達(dá)元件的外植體再生能力;C2和D1的AtGRF5以及D1的AtPLT5轉(zhuǎn)化后再生率極顯著高于CON;C2中表達(dá)AtPLT5和AtWIND1,D1中表達(dá)AtWUS和AtWIND1的再生率顯著高于CON(圖5-B)。對(duì)所得到的超表達(dá)DRs再生植株進(jìn)行PCR鑒定分析,分析再生陽(yáng)性苗率(再生陽(yáng)性苗率=再生陽(yáng)性苗/接種外植體×100%)(表2),超表達(dá)AtGRF5和AtPLT5的C1和C2、超表達(dá)AtPLT5的D1,超表達(dá)AtGRF5的D2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗占外植體比例極顯著高于相應(yīng)的對(duì)照CON。

表2 超表達(dá)DRs遺傳轉(zhuǎn)化甜瓜種質(zhì)的分析

3 討論與結(jié)論

選擇適宜的外植體是遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵因素之一,子葉、莖段、頂芽、幼胚、莖尖、胚軸等都具有轉(zhuǎn)化能力。不同外植體或者同一外植體的不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)化效率差異較大。具備分裂能力的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率最高。本研究在不同基因型甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中,選取種子在28 ℃預(yù)培養(yǎng)24～48 h,此時(shí)胚根長(zhǎng)度為0.2～0.5 cm時(shí)的子葉外植體近軸端芽再生能力最強(qiáng),并且在預(yù)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂提高代謝活躍性,對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。另一方面提高農(nóng)桿菌浸染外植體效率也是遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié),很多研究者通過超聲波處理、玻璃微珠處理、刀片微創(chuàng)和硼酸鋁晶須等方法對(duì)外植體造成創(chuàng)傷[18-20],促進(jìn)農(nóng)桿菌與傷口區(qū)域充分接觸。本研究采用納米刷對(duì)甜瓜子葉外植體創(chuàng)制微傷口,此外與超聲波和真空滲透處理相結(jié)合,減小農(nóng)桿菌進(jìn)入子葉外植體細(xì)胞的阻力[8]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在-1.0 kPa真空滲透壓處理后外植體的轉(zhuǎn)化率最高,然而造傷和農(nóng)桿菌雙重因素極易產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷,進(jìn)而影響外植體的存活率和再生能力。研究表明,在培養(yǎng)基中添加一些抗氧化劑如硝酸銀(AgNO3)、半胱氨酸(Cys)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、硫辛酸(LA)和二硫蘇糖醇(DTT)等降低浸染后外植體褐化和死亡率[21-24]。其中LA是一種含硫抗氧化劑,廣泛存在于原核和真核生物中,主要通過直接清除活性氧和活性氮,螯合金屬離子發(fā)揮抗氧化作用,循環(huán)再生其余內(nèi)源抗氧化劑,增加線粒體膜電位和細(xì)胞氧消耗來降低活性氧產(chǎn)生等,最終實(shí)現(xiàn)有效減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[25]。本研究在共培養(yǎng)基中添加低濃度的LA以減輕外植體造傷脅迫后的褐化,在誘導(dǎo)芽再生培養(yǎng)基中加入乙烯抑制劑AgNO3能夠提高細(xì)胞中酶的活性,促進(jìn)不定芽的再生。除了采用物理的方式提高農(nóng)桿菌侵染外植體的效率,利用革蘭氏陰性細(xì)菌如丁香假單胞桿菌的分泌系統(tǒng)T3SS在農(nóng)桿菌中表達(dá),將三型效應(yīng)子T3Es如AvrPto、AvrPtoB、HopAO1運(yùn)送到細(xì)胞中,以阻斷植物PTI反應(yīng)來提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率[26]。

注:同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示每種甜瓜種質(zhì)處理間差異極顯著(P<0.001)?！皀s”表示沒有統(tǒng)計(jì)。

植物的再生和遺傳轉(zhuǎn)化是基因工程應(yīng)用的基礎(chǔ)。然而遺傳轉(zhuǎn)化及細(xì)胞再生能力由受體植物基因型與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用下的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所決定[27]。發(fā)育調(diào)控基因如WUS、PLT、ARF、GRF、LEC1、LEC2、BBM、LBDs、CUC1、CUC2、CLV3、STM和ESR是一類決定植物細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素,它們的表達(dá)與愈傷組織的形成和植株再生能力緊密相關(guān)[28-29]。目前發(fā)育調(diào)控因子被挖掘并應(yīng)用到農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)和植物地上部注射轉(zhuǎn)化試驗(yàn)[30]。WUS和BBM基因已經(jīng)應(yīng)用到單子葉作物再生研究中,在難轉(zhuǎn)化的玉米自交系中超表達(dá)BBM和WUS2基因能夠顯著提高組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化效率,但是WUS和BBM基因在雙子葉植物中應(yīng)用的成功案例較少[13,31]。Maher等將含有來源于玉米的WUS2、STM和IPT與CRISPR元件共表達(dá)的農(nóng)桿菌混合后注射到煙草側(cè)芽生長(zhǎng)點(diǎn)獲得遺傳轉(zhuǎn)化且基因編輯的植株[30]。GRF基因是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子,常以GRF-GIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形式促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)和生殖器官原基細(xì)胞的發(fā)育。其中超表達(dá)GRF5能夠促進(jìn)愈傷組織分化以及芽的形成[10]。PLT5是植物組織受傷后莖稈維管修復(fù)的重要調(diào)控基因,在擬南芥中超表達(dá)PLT5能夠促進(jìn)在無(wú)細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基上愈傷組織再生得到苗[32],在高濃度細(xì)胞分裂素作用下,PLT5誘導(dǎo)表達(dá)量超過WUS,從而促進(jìn)了芽的再生[33]。當(dāng)PLT5和WUS共表達(dá)時(shí),能夠協(xié)同促進(jìn)胚性愈傷組織的形成并重塑細(xì)胞發(fā)育途徑獲得再生芽。WIND1也是植物機(jī)械損傷后促進(jìn)傷口處維管形成層細(xì)胞分裂并交織連接的關(guān)鍵基因,在無(wú)外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用下超表達(dá)擬南芥的WIND1能夠促進(jìn)愈傷組織分化,表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因分析得出WIND1能夠直接上調(diào)ESR1基因的表達(dá)從而激活CUC1介導(dǎo)的芽再生發(fā)育途徑[34]。由于上述部分DRs基因可以在沒有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚發(fā)生,為避免在高濃度植物激素作用下超表達(dá)DRs基因會(huì)導(dǎo)致再生芽畸形、植物形成困難的問題,本研究在低濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中,超表達(dá)AtGRF5、AtWUS、AtPLT5和AtWIND1能夠促進(jìn)甜瓜“U”形口不定芽的正常再生,其中AtGRF5和AtPLT5在個(gè)別甜瓜材料中促進(jìn)再生芽比例與對(duì)照相比呈現(xiàn)極顯著差異。AtPLT5的作用是細(xì)胞全能性的獲得(pluripotency acquisition),促進(jìn)愈傷組織的分化進(jìn)而轉(zhuǎn)向胚性芽再生發(fā)育途徑,AtWIND1是促進(jìn)芽原生分生組織(shoot promeritem)分化,AtWUS是芽祖細(xì)胞(shoot progenitor)形成的基因,決定著再生器官如芽組織的分化,在芽從頭形成的信號(hào)途徑中,PLT基因位于最上游。GRF基因與GIF形成復(fù)合體調(diào)控著植物器官原基細(xì)胞的分化,超表達(dá)GRF類基因能夠促進(jìn)植物器官的發(fā)生[10],此外GRF5與GIF1-SWI/SNF形成復(fù)合體繼而解除PRC2復(fù)合體對(duì)其他發(fā)育調(diào)控因子的抑制,最終重塑細(xì)胞再生[29]。因此,面對(duì)甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率偏低的現(xiàn)狀,需要依據(jù)模式作物分生組織再生調(diào)控途徑,結(jié)合甜瓜維管形成層的發(fā)育特征,充分利用DRs基因資源才是重要的解決途徑。