趙佳祗,沈曉怡,黃雅芳

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院 心血管內(nèi)科,浙江 杭州 311201)

化學(xué)療法是癌癥治療的主要策略之一[1]。但長期反復(fù)靜脈化療可能會引起多種毒性作用,包括神經(jīng)毒性、腎臟毒性和靜脈損傷等[2]。接受化療的患者中有70%會出現(xiàn)靜脈炎毒理反應(yīng),但目前仍無有效用于臨床的化療性靜脈炎治療藥物[3]。研究表明,中藥大黃(Chinese rhubarb)可減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng),其中大黃素(emodin, EMO)具有抗炎癥、抗腫瘤和血管舒張等功效[4],但關(guān)于EMO對化療性靜脈炎的抗炎作用和機制的研究仍不清楚。本研究探討EMO濕敷穿刺部位對化療性靜脈炎的預(yù)防作用,以及對靜脈穿刺點周圍血清VEGF、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin6,IL-6)表達水平的作用和機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與耗材 長春新堿(vincristine, VCR)注射液(10 mg /小瓶)購于浙江海順制藥有限公司,用5 mL生理鹽水稀釋。多磺酸粘多糖乳膏貼膏(MPS cream patch, MP)(含量3%)購于德國Sankyo Pharmaceutical公司。EMO(純度98.0%)購于上海Aladdin公司,將0.5 g EMO用2 mL的石蠟油溶解,隨后用白色凡士林將溶解后的EMO稀釋為2%的EMO軟膏。蘇木精伊紅(H&E)染色試劑盒、NF-κBp65(p-P65),p-IκBα、p-IKKβ和內(nèi)參蛋白GAPDH均購于美國Abcam公司,偶合辣根過氧化物的二抗購于美國Abcam公司。TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 動物及分組 雄性無特定病原(specified pathogen free, SPF)級的新西蘭大白兔購于西安交通大學(xué)實驗動物中心,體質(zhì)量1.81～2.43 kg,飼養(yǎng)于光照/黑暗周期為12 h、空氣溫度(26±1)℃環(huán)境,自由飲水和采食。實驗按照中國動物福利指南進行,并通過我院倫理委員會審批。

參考相關(guān)文獻[5]建立化療性靜脈炎兔模型。將48只新西蘭兔以隨機數(shù)字表法分為6組,每組8只,包括:正常對照組(NC組),模型對照組(MC組),石蠟油溶劑和凡士林稀釋的EMO外敷治療組(EMO+MC組),多磺酸粘多糖乳膏貼膏治療組(MP+MC組),核因子NFκB的抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷銨(pyrrolidinedithiocarbamate ammonium, APDC)靜脈注射結(jié)合EMO外敷處理MC組(APDC+EMO+MC組)、APDC靜脈注射處理MC組(APDC+MC組)。NC組不進行任何干預(yù);MC組制作動物模型,輸注同等劑量的生理鹽水,不給予任何干預(yù)措施;MP+MC組每次輸液后在靜脈穿刺上方沿血管走向均勻涂抹多磺酸粘多糖乳膏,膏體長3 cm,2 h涂抹1次;EMO+MC組將EMO濕紗布在每次輸液后在靜脈穿刺上方外敷,濕敷30 min,2 h更換1次;APDC+EMO+MC組將EMO濕紗布在每次輸液后在靜脈穿刺上方外敷,并使用100 μM/kg的APDC靜脈注射(每天2次,右耳周圍靜脈注射)聯(lián)合EMO濕敷30 min(2 h更換1次);APDC+MC組使用100 μM/kg的APDC靜脈注射(每天2次,右耳周圍靜脈注射)治療。除NC組以外,其他動物每天2次通過右耳周圍靜脈注射VCR(3.0 mg/kg),每小時5 mL/kg持續(xù)30 min。處理48 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 耳靜脈組織 安樂死兔子,收集耳組織切片后用蘇木精和伊紅(HE)染色,評估各組新西蘭兔耳組織病理學(xué)變化,觀察耳靜脈病理變化[5]。

1.3.2 VEGF和bFGF的表達水平 實時熒光定量PCR(RTqPCR)檢測VEGF和bFGF的表達。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參基因,1.5%瓊脂糖凝膠電泳評估擴增結(jié)果。引物序列如下:VEGF正向為5’-GCGATAACTCTCCTTATACCAGCTT-3’,反向為5’-CCACTAATGGGAGCGACTATTGCGT-3’;bFGF正向為5’-CCGAGATACATTCGGCCGATCAAC-3’,反向為5’-CGAGGTTGCTATAGGCTCCGAGGAC-3’;GAPDH正向為5’-TGAAGGTCGGTG TGAACGGA-3’,反向為5’-ACAAGCTTCCCATT CTCGGC -3’。

1.3.3 p-p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白水平 收集耳組織并勻漿,蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測p-p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白的表達。

1.3.4 TNF-α和IL-6水平 收集新西蘭兔的穿刺點靜脈血,ELISA法檢測細胞因子TNF-α和IL-6的表達水平,嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 耳靜脈組織病理學(xué)表現(xiàn) EMO抑制VCR引起兔耳靜脈炎癥和水腫。MC組耳靜脈的完整性結(jié)構(gòu)受損,在血管組織內(nèi)和周圍觀察到大量血細胞,大量炎性細胞浸潤真皮,真皮間質(zhì)中大量液體積聚導(dǎo)致組織水腫。見封三圖1。MP+MC組的組織學(xué)圖像與MC組接近;EMO+MC組中耳靜脈完整性部分恢復(fù),炎性浸潤改善,真皮組織部分修復(fù)。各組的組織學(xué)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),EMO+MC組的評分高于NC組,低于MP+MC組,見表1。

表1 各組兔耳組織的組織學(xué)評分Table 1 Histological scores of rabbit ear tissue in each

2.2 血清TNF-α、IL-6和VEGF、bFGF mRNA的表達水平 檢測結(jié)果顯示,各組血清TNF-α、IL-6和VEGF、bFGF mRNA的表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),均為EMO+MC組高于NC組、低于MC組和MP+MC組。見表2。

表2 各組兔靜脈穿刺點周圍血清TNF-α、IL-6和VEGF、bFGF mRNA的表達水平Table 2 mRNA expression levels of TNF-α, IL-6, VEGF and bFGF around venipuncture sites in rabbits of each

2.3 p-p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白水平 Western blot結(jié)果顯示,與NC組比較,MC組耳組織中p-p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白表達水平上調(diào);與MC組比較,EMO+MC組的p-p65、p-IκBα、p-IKKβ的表達水平明顯降低;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組間p65、IκBα、IKKβ的蛋白表達水平,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法顯示EMO對靜脈炎兔耳組織中NF-κB信號激活的影響Figure 1 The effect of EMO on the activation of NF-κB signal in the ears of rabbits with phlebitis was demonstrated by Western blotting

2.4 APDC聯(lián)合大黃素影響血清促炎因子和生長因子的表達水平 與MC組比,APDC+EMO+MC組和APDC+MC組耳組織的靜脈穿刺點周圍血清中TNF-α、IL-6濃度和VEGF、bFGF mRNA水平都下調(diào),且APDC+EMO+MC組低于APDC+MC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與EMO+MC組比較,APDC+EMO+MC組靜脈穿刺點周圍血清中TNF-α、IL-6濃度和VEGF、bFGF的mRNA水平都下調(diào)(均P<0.05),見表3。

表3 APDC聯(lián)合EMO治療影響兔靜脈穿刺點周圍血清TNF-α、IL-6濃度和VEGF、bFGF mRNA水平(n=8)Table 3 Effects of APDC combined with EMO on serum TNF-α and IL-6 concentrations and VEGF and bFGF mRNA levels around venipunction sites in rabbits(n=8)

3 討論

大黃具有瀉熱通腸、涼血解毒等作用,常用于治療炎癥相關(guān)疾病[6],其具有調(diào)節(jié)血管炎癥的作用[7-8]。EMO是大黃中的主要有效單體活性成分,除了對胃腸道的作用外,還具有血管舒張、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧化、抗菌抗炎、抗癌等作用[9]。本研究建立化療性靜脈炎兔模型,通過實驗觀察EMO濕敷穿刺部位對化療性靜脈炎的預(yù)防作用,并探討EMO治療后兔耳組織以及靜脈穿刺點周圍VEGF、bFGF、TNF-α、IL-6的表達變化和NF-κB信號通路激活的變化,以期為研究大黃素對化療性靜脈炎的預(yù)防作用提供動物實驗依據(jù)。本研究結(jié)果初步解釋了EMO在預(yù)防化療性靜脈炎中的分子機制。

VCR是夾竹桃科植物長春花中提取出的生物堿,是重要的抗癌化療藥物,VCR通常通過周圍靜脈注入,并引起嚴重的局部靜脈毒性,例如血管痛、靜脈炎和靜脈血栓栓塞[10]。本研究結(jié)果中使用按體重3.0 mg/kg的VCR濃度給藥,明顯引起兔靜脈炎的臨床表現(xiàn)。連續(xù)48 h靜脈輸注后,在受VCR攻擊的兔耳組織中觀察到嚴重靜脈炎,其特征是靜脈內(nèi)皮細胞丟失、通透性過高、間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤等。TNF-α和IL-6是眾所周知的促炎細胞因子,可以增強白細胞黏附,血管滲漏和炎癥級聯(lián)反應(yīng)。健康的血管組織表達少量的VEGF和bFGF,而當(dāng)血管受損時,VEGF和bFGF的表達出現(xiàn)明顯增高[11],而且EMO已被證明可以減少急性肺損傷大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和VEGF的表達[7]。本研究中VCR注射的兔子,其血清TNF-α、IL-6、VEGF和bFGF的水平均明顯高于正常動物,因此暴露于VCR可能會導(dǎo)致血清中各種炎癥細胞因子的釋放增加、血管生成因子表達增加和兔耳組織的局部炎癥。接受EMO的治療不僅可以逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng),還可以降低血清TNF-α、IL-6、VEGF和bFGF的水平。這表明生物活性化合物EMO對VCR引起的靜脈炎具有明顯的治療作用。

NF-κB信號通路的激活可加速炎癥介質(zhì)(如TNF-α,IL-6)的過度釋放[12-13],而EMO能抑制炎癥反應(yīng)中的NF-κB信號通路的激活[7]。在本研究中,VCR上調(diào)了兔耳組織中p-p65,p-IκBα、p-IKKβ的表達,表明VCR加速了NF-κB信號通路的激活。但是,EMO可以逆轉(zhuǎn)NF-κB信號通路的激活。有趣的是,NF-κB信號通路抑制劑APDC聯(lián)合EMO更明顯地抑制了TNF-α,IL-6、VEGF、bFGF因子。因此,EMO組可以通過抑制NF-κB信號通路抑制炎癥因子和血管生成因子的增加,從而改善化療藥物誘發(fā)的靜脈炎。

綜上所述, EMO可以通過抑制NF-κB信號通路減少體內(nèi)促炎和內(nèi)皮相關(guān)細胞因子的生成,而減輕VCR引起的靜脈炎。本研究結(jié)果推進了TCM對化療性靜脈炎治療的機制的理解,并為EMO用于臨床外用藥提供了前期動物實驗依據(jù)。