覃林莽 林浩博 王婕穎 張光峰 徐 婷 張 曉

肺纖維化是一種病死率很高的肺部疾病,是眾多間質(zhì)性肺病終末期的共同結(jié)局,患者通常由于藥物、遺傳因素或暴露于射線等環(huán)境中導致肺組織反復損傷,最終發(fā)展為肺纖維化。盡管病因可能有所不同,但病理學機制相似,其特征在于炎癥觸發(fā)后引起肺組織中細胞外基質(zhì)的分泌和膠原蛋白的顯著積累[1]。當肺成纖維細胞受到炎性細胞因子和趨化因子[如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1]觸發(fā)時,便產(chǎn)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(fibroblast-to-myofibroblast transformation, FMT),分泌大量細胞外基質(zhì)沉積于肺部,并且表達大量收縮蛋白,如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和纖維連接蛋白(Fibronectin)[2]。這些蛋白幫助肌成纖維細胞在肺內(nèi)彌漫并促進組織瘢痕形成,該過程被認為是不可逆的,因此抑制由TGF-β1誘導FMT的過程可能是治療肺纖維化一種較有前景的方法。哺乳動物中存在3種不同形式的TGF-β(TGF-β1、β2和β3),每一種都在全身廣泛表達[3]。盡管所有3種同工型TGF-β都使用相同的高親和力細胞表面受體,但它們的生物學功能大不相同[4]。其中TGF-β3主要發(fā)揮免疫負調(diào)控的作用,如在小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡中LAG3+調(diào)節(jié)性T細胞通過產(chǎn)生TGF-β3來抑制體內(nèi)B淋巴細胞活性從而發(fā)揮保護作用[5～7]。此外,在癌癥患者中TGF-β3的升高則會抑制免疫細胞導致癌細胞播散,TGF-β3和血小板反應蛋白-1聯(lián)合使用可抑制巨噬細胞極化[8,9]。

有研究還顯示,不僅 TGF-β3沒有促纖維化作用,而且外源性給予重組 TGF-β3 還可以減少皮膚損傷[10,11]。研究表明,TGF-β3具有調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)化和抑制炎癥的能力,可能在免疫性疾病中發(fā)揮治療作用。由此,本研究設(shè)想TGF-β3可能通過拮抗TGF-β1介導的成纖維細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而改善肺纖維化。因此,本研究旨在評估TGF-β3是否能夠抑制TGF-β1誘導的人原代肺成纖維細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化并通過此機制抑制肺纖維化疾病的進展。

材料與方法

1.主要材料:TGF-β1和TGF-β3因子購自美國PeproTech公司;博來霉素購自德國Merck公司;抗α-SMA抗體、抗Fibronectin抗體、Alexa Fluor 488羊抗鼠熒光二抗和Alexa Fluor 594羊抗兔熒光二抗購自英國Abcam公司;Transwell小室購自美國Corning公司;Invasion小室購自美國BD公司。

2.原代人肺成纖維細胞培養(yǎng):無菌條件下,選取年齡<60歲,無感染的肺癌患者,遠離腫瘤組織的正常肺組織,將組織塊剪碎成1mm3大小,均勻鋪于60mm培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿倒置放于37℃、5%CO2細胞孵育箱中,使其組織塊干燥且能黏附于培養(yǎng)皿底部,2h后加入含20%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基4ml。之后3～4天內(nèi)減少翻動,直至細胞緩慢游出形成集落時將組織塊移除,每隔3～4天更換新鮮培養(yǎng)基,待細胞增殖至90%融合度后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,傳代采用差速貼壁法對HLF進行純化,取第4～8代細胞進行后續(xù)實驗。所有肺臟組織在取材前均取得患者的知情同意,且獲得廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理學審批號:GDREC2016076A)。

3.細胞遷移和侵襲實驗:①對照組:給予等體積超純水;②TGF-β1組:細胞給予TGF-β1(4ng/ml)處理HLF 24h;③TGF-β3組:細胞給予20ng/ml的TGF-β3預處理24h后加入TGF-β1(4ng/ml)處理24h。用無血清杜式改良培養(yǎng)基重懸細胞,下室中加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,上室加入200μl細胞懸液,于細胞孵箱培養(yǎng)24h。磷酸鹽緩沖液清洗3次,濾膜上層細胞用棉簽擦除,甲醇固定15min,0.1%結(jié)晶紫染色15min,顯微鏡下觀察計數(shù),隨機挑選5個視野細胞數(shù)進行統(tǒng)計分析。若為侵襲實驗,則用包被有基質(zhì)膠的小室,下室加15%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h。

4.Western blot法檢測:將HLF均勻鋪于6孔板中,分為對照組、TGF-β1組及TGF-β3組。24h后待細胞長至90%后吸去培養(yǎng)基,預冷磷酸鹽緩沖液清洗,加入蛋白裂解液置于冰上裂解30min,用刮刀收集細胞裂解液,12000r/min,4℃離心15min。收集上清,加入十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液后于100℃煮沸10min進行蛋白變性。取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白分離,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1h后加入一抗(稀釋比例均為1∶1000)4℃孵育過夜,次日加入二抗(1∶5000)室溫孵育1h,于化學發(fā)光成像儀拍照并分析結(jié)果,Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

5.動物模型構(gòu)建與方法:8周齡無特定病原體級雄性C57BL/6小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司 [合格證號:SCXK(蘇)2018-0008],體質(zhì)量為30～35g。將動物隨機分為3組,每組6只,對照組:給予等體積0.9%氯化鈉溶液氣管滴注;模型組:博來霉素溶于0.9%氯化鈉溶液,按2.0U/kg體質(zhì)量的濃度給予小鼠氣管內(nèi)滴注[12]; TGF-β3組:于造模前1天,將TGF-β3(100μg/kg)給予小鼠尾靜脈注射。于造模28天后,頸椎脫臼處死小鼠,取肺組織進行病理學研究及免疫熒光實驗。本實驗已獲廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理學審批號:GDREC2018212A)。

6.HE和Masson染色:小鼠右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后,用石蠟包埋,使用切片機將其切成4μm厚度,采用HE和Masson染色方法,按照標準染色方案進行染色,光學顯微鏡下觀察各組肺組織病理學變化并拍照保存。

7.免疫熒光:肺組織切片經(jīng)4%多聚甲醛固定后,加入0.3%TritonX-100進行通透20min,5%牛血清蛋白室溫封閉1h后加入一抗孵育過夜。洗滌3次后加入熒光二抗室溫避光孵育1h,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染細胞核,在激光共聚焦顯微鏡下拍照并保存圖片。

結(jié) 果

1.各組肺成纖維細胞遷移和侵襲結(jié)果顯示,與對照組比較,HLF經(jīng)TGF-β1刺激后,遷移和侵襲的細胞數(shù)明顯增多,遷移和侵襲能力增強,而預先給予TGF-β3處理可降低遷移和侵襲的細胞數(shù),提示TGF-β3可抑制TGF-β1誘導的細胞遷移和侵襲能力,詳見圖1。

圖1 各組肺成纖維細胞遷移和侵襲實驗結(jié)果

2.各組肺成纖維細胞Western blot法檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,TGF-β1組α-SMA和Fibronectin蛋白表達量明顯增加;而與TGF-β1組比較,TGF-β3組中α-SMA和Fibronectin蛋白表達量明顯降低,提示TGF-β3可顯著抑制TGF-β1刺激的HLF間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達,詳見圖2。

圖2 各組肺成纖維細胞α-SMA和Fibronectin蛋白的表達

3.各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)增厚,而預先給予TGF-β3處理改善了博來霉素引起的肺組織病理學改變;Masson染色結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組肺組織膠原沉積明顯增加,而TGF-β3組膠原沉積明顯減少,提示TGF-β3可改善博來霉素引起的病理形態(tài)的改變,減少膠原累積,詳見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織切片HE和Masson染色(×200)

4.各組小鼠肺組織免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠肺組織α-SMA和Fibronectin蛋白熒光強度明顯增加;而與模型組比較,TGF-β3組α-SMA和Fibronectin蛋白熒光強度明顯減弱。提示TGF-β3明顯降低了博來霉素引起的α-SMA和Fibronectin蛋白的表達,詳見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織α-SMA、Fibronectin表達(免疫熒光,×200)

討 論

肺纖維化是一種危害性極大的不可逆疾病,肺移植往往是患者的最終選擇,臨床上亟須更多強有力的靶向治療措施。體內(nèi)各種來源的細胞,如上皮細胞、肺部常駐成纖維細胞和循環(huán)中的纖維細胞,間質(zhì)轉(zhuǎn)化或增殖分化為成纖維細胞和肌成纖維細胞,產(chǎn)生過量膠原沉積是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的特征,其中肺部常駐成纖維細胞是肺纖維化疾病進展過程中主要的靶細胞[13]。在過去的20年里,大量證據(jù)表明,FMT是肺纖維化發(fā)病機制中的主要促纖維化機制,而TGF-β1是FMT過程中的關(guān)鍵性細胞因子,它介導成纖維細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,分泌細胞外基質(zhì)和膠原沉積,高表達α-SMA和Fibronectin表現(xiàn)出類似平滑肌細胞的收縮性和纖維細胞的特性,細胞由此獲得異常增強的遷移和侵襲能力[14～16]。同屬同一家族中的TGF-β3化學結(jié)構(gòu)與TGF-β1相似,但發(fā)揮的作用不同。

在國內(nèi)外的研究中,TGF-β3已被證實在多種疾病中發(fā)揮治療作用,但在肺纖維化中的作用研究僅見少數(shù)報道,其發(fā)揮的治療作用和安全性仍有待于考究[7～11,17,18]。本研究嘗試將TGF-β3作用于TGF-β1刺激的肺成纖維細胞,觀察其產(chǎn)生的細胞功能的變化,并且采用原代人肺成纖維細胞進行研究,在消除種屬差異帶來影響的同時可以更真實地反映TGF-β3抑制成纖維細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化在細胞層面的作用機制,結(jié)果顯示TGF-β3抑制了TGF-β1誘導的HLF遷移和侵襲能力,和下調(diào)了間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的設(shè)想在體外實驗中得到了證實,筆者提供了 TGF-β3抑制TGF-β1的新證據(jù),表明TGF-β3發(fā)揮拮抗TGF-β1介導的FMT作用。

為了進一步證實TGF-β3在體內(nèi)同樣也具有治療作用,筆者嘗試通過尾靜脈給藥的方式將TGF-β3注射到肺纖維化小鼠體內(nèi),評估TGF-β3是否也能在體內(nèi)抑制FMT,進而改善肺纖維化病情。構(gòu)建肺纖維化模型方法眾多,筆者選擇了其中易于操作、重復性高、造模效果穩(wěn)定的博來霉素氣管滴注法[19]。博來霉素誘導小鼠肺纖維化主要分為3個時期,第1～7天為組織損傷期、第8～14天為炎性反應期,第15～28天為組織異常修復期,即纖維化形成期。28天后取小鼠肺組織進行組織學染色,模型組小鼠肺組織明顯發(fā)生改變,可見膠原沉積增多、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺間質(zhì)明顯增厚,提示肺纖維化模型構(gòu)建成功。其病理過程為成纖維細胞和炎性細胞分泌的TGF-β1等促炎性細胞因子導致原本常駐在肺部的成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,肌成纖維細胞異常活化表達大量間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白標志如α-SMA和Fibronectin,高表達α-SMA細胞獲得類似平滑肌細胞的收縮性質(zhì),拉扯正常肺泡組織導致結(jié)構(gòu)的紊亂。高表達Fibronectin細胞分泌過量膠原纖維沉積于細胞外和肺泡間隔,導致膠原累積和肺間質(zhì)的增厚,最終形成瘢痕導致肺纖維化,而以上病理形態(tài)的變化均可被預先給予TGF-β3處理過的肺纖維模型所抑制,表現(xiàn)為肺組織病理形態(tài)的改善,以及α-SMA和Fibronectin蛋白熒光強度明顯降低,說明了TGF-β3在體內(nèi)具有治療肺纖維化的作用。

本研究表明在體外實驗中,TGF-β3可抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,且在體內(nèi)實驗中,TGF-β3改善肺纖維化同樣存在著肺間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的下調(diào),因此,筆者推測TGF-β3改善肺纖維化的機制,可能便是通過拮抗TGF-β1發(fā)揮的FMT作用,減弱成纖維細胞的遷移和侵襲能力,下調(diào)間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白標志而實現(xiàn)。綜上所述,本研究結(jié)果初步揭示了TGF-β3有望作為臨床生物學標志物,在肺纖維化中發(fā)揮治療作用。今后的研究將深入探討TGF-β3抑制TGF-β1的FMT作用所參與信號轉(zhuǎn)導通路,為未來開發(fā)抗纖維化藥物提供更多的理論依據(jù)。