關(guān)天富 段 莉 王大平

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是最常見(jiàn)的退行性疾病,其病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞,軟骨下骨硬化及骨贅形成,目前尚缺乏有效的治療手段[1]。軟骨細(xì)胞移植目前作用于軟骨損傷修復(fù)及軟骨組織工程研究,被認(rèn)為是治療骨關(guān)節(jié)炎的可行方法,但其增殖、分化能力差,而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有優(yōu)異的多分化潛能,其軟骨分化潛能在軟骨損傷、骨關(guān)節(jié)炎修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用,可作為軟骨修復(fù)的種子細(xì)胞[2]。

kartogenin(KGN)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種低分子化合物,可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化,核結(jié)合因子CBFβ(core binding factor-β)是低分子化合物KGN促M(fèi)SCs成軟骨分化的下游通路中的關(guān)鍵因子[3]。當(dāng)KGN分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),通過(guò)與其配體絲蛋白A(filamin A, FLNA)結(jié)合,該蛋白除了可作為KGN結(jié)合的配體外,還與CBFβ結(jié)合。而FLNA通常與CBFβ結(jié)合形成復(fù)合體存在胞質(zhì)當(dāng)中,當(dāng)CBFβ與FLNA分離后,進(jìn)入細(xì)胞核與DNA轉(zhuǎn)錄因子RUNX1結(jié)合形成二聚體,激活下游通路[4],由此可見(jiàn),CBFβ的入核可能是KGN發(fā)揮作用的重要一環(huán)。最早的核定位信號(hào)序列在1984年于SV40病毒大T抗原上發(fā)現(xiàn),研究認(rèn)為,大多數(shù)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核需要核定位信號(hào)的參與[5]。因此,構(gòu)建核定位CBFβ表達(dá)載體,能進(jìn)一步探討核定位CBFβ對(duì)MSCs成軟骨分化的作用。

腺相關(guān)病毒(adeno associated virus,AAV)由于其廣泛的組織嗜性和低免疫原性,被應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn),目前為止已經(jīng)有兩種基于AAV的療法在歐美國(guó)家獲得了監(jiān)管部門(mén)的批準(zhǔn)[6]。而本研究應(yīng)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建pAAV-NLS-CBFβ-RFP表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)PEI轉(zhuǎn)染法將該質(zhì)粒和pAAV-RC、pAAV-Helper共轉(zhuǎn)染至AAV-293細(xì)胞中,包裝生成重組腺相關(guān)病毒rAAV-NLS-CBFβ-RFP,為進(jìn)一步的基因療法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

資料與方法

1.一般資料:細(xì)胞AAV包裝質(zhì)粒pAAV-MCS(山東維真生物科技有限公司)。感受態(tài)細(xì)菌STBL3、AAV-293細(xì)胞系及兩種腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒pHelper、pAAV-RC由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM(美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)液,胎牛血清(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司),EcoRⅠ和HindⅢ限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶(廣州瑞真生物技術(shù)有限公司),質(zhì)粒抽提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司),DNA測(cè)序[生工生物工程(上海)股份有限公司]。轉(zhuǎn)染試劑PEI Polysciences配成儲(chǔ)存液(2mg/ml)。膠回收試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)。

2.目的基因的獲取:CBFβ的序列,設(shè)計(jì)合成引物:NLS-CBFβ-RFP上游引物:5′- CGGAATTCGCTAGCATGAAGAGGCCT-3′, 下游引物:5′-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTC-3′。該序列中包含EcoRⅠ (5′-G^AATTC-3′)和HindⅢ (5′-A^AGCTT-3′)酶切位點(diǎn)。將合成的引物稀釋成10μmol/L,分別取正向引物和反向引物各15μl,加入至50μl反應(yīng)體系,按照PCR試劑盒反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94℃ 5min,(98℃ 10s,55℃ 30s,72℃ 1min)×30 個(gè)循環(huán),72℃ 2min。Qiagen試劑盒提純回收產(chǎn)物。取回收產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn)目的基因NLS-CBF-RFP片段擴(kuò)增成功,切膠后使用試劑盒回收。

3.構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒載體[7]:將腺病毒穿梭質(zhì)粒pAAV-MSC和PCR 擴(kuò)增獲得的含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的片段分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ在37℃進(jìn)行雙酶切1h,95℃滅活限制性?xún)?nèi)切酶,取酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶于37℃連接1h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化STBL3感受態(tài)細(xì)菌, 氨芐霉素篩選陽(yáng)性克隆, 12～16h 后挑取克隆, 氨芐抗性的LB培養(yǎng)基搖菌, Qiagen試劑盒提取質(zhì)粒;所提取的質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切進(jìn)行鑒定, DNA測(cè)序驗(yàn)證,證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:利用AAV Helper Free System包裝系統(tǒng),將生長(zhǎng)至80%密度的AAV-293(1.0～1.5)×106細(xì)胞傳代至10cm培養(yǎng)皿,在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。當(dāng)細(xì)胞融合度至約80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pAAV-NLS-CBFβ-RFP (10μg)、pHelper (12μg)及pAAV-RC (8μg)3質(zhì)粒共30μg加入350μl DMEM,再加入30μl PEI轉(zhuǎn)染試劑,震蕩10s,短暫離心,靜置15min,共轉(zhuǎn)染至AAV-293細(xì)胞。顯微鏡下監(jiān)測(cè)AAV-293細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞毒性反應(yīng),并于48h后,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算AAV-293細(xì)胞中表達(dá)紅色熒光蛋白的比例,確定細(xì)胞的包裝效率。

5.病毒純化:轉(zhuǎn)染72h后,收獲AAV-293細(xì)胞以及培養(yǎng)上清液,細(xì)胞懸液在干冰-乙醇浴和37℃水浴交替下凍融3個(gè)循環(huán)。每個(gè)凍融時(shí)間為10min。然后加入1/10體積的氯仿,置于37%搖床中劇烈振搖至細(xì)胞完全溶解破裂,加入固體氯化鈉至終濃度1mol/L,室溫下振搖溶解,4℃ 12000r/min離心15min,取出上層水相加固態(tài)PEG 8000至終濃度10%,振搖溶解后冰浴1h,4℃ 11000r/min離心15min,移除上清液,沉淀用適量PBS緩沖液洗脫離心管管底和管壁上的沉淀,加DNase和RNase至終濃度1μg/ml,室溫下消化30min。再加等體積氯仿抽提,4℃ 12000r/min離心5min,無(wú)菌操作下小心吸出上層水相,即為濃縮純化的rAAV-CBFβ-RFP病毒液。

6.人關(guān)節(jié)液MSCs的純化與體外培養(yǎng)[8]:經(jīng)深圳市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn),關(guān)節(jié)液樣本取自深圳市第二人民醫(yī)院的捐贈(zèng)者。關(guān)節(jié)液通過(guò)細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾(40μm 尼龍,美國(guó)FALCON公司),并在室溫下以1000×g離心5min,棄去上清液,用完全培養(yǎng)基重懸沉淀 (Gibco培養(yǎng)基,添加10% FBS和1%青霉素-鏈霉素),然后在 T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。5天后,去除非貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)基每隔2天更換1次,第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

7.CBFβ表達(dá)水平檢測(cè):提取細(xì)胞的總RNA,利用RT-PCR檢測(cè)CBFβ表達(dá)水平。按照試劑盒要求,提取細(xì)胞的總RNA,并對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板,用CBFβ和GAPDH的特異性上游以及下游引物,分別對(duì)目的基因CBFβ和內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系按照SYBRⅡ熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,用CFX96 real-time系統(tǒng)(Thermal Cycler,美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行檢測(cè)。采用相對(duì)定量法進(jìn)行CBFβ水平分析,CBFβ的表達(dá)水平用2-ΔΔCq表示,其中ΔCq=Cq(CBFβ)-Cq(GAPDH)。以無(wú)處理的SF-MSCs為空白對(duì)照組,感染rAAV-U6病毒的SF-MSCs為陰性對(duì)照組,以感染rAAV-CBF-RFP的SF-MSCs為實(shí)驗(yàn)組,設(shè)定 CBFβ表達(dá)水平基線為0,比較3組表達(dá)水平。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用GraphPad Prism8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖,使用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.重組腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建、同源重組和鑒定:pAAV-NLS-CBFβ-RFP經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定(圖1)及DNA測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)的NLS-CBFβ-RFP序列同源性100%,說(shuō)明NLS-CBFβ-RFP已被成功克隆至穿梭質(zhì)粒pAAV-NLS-CBFβ-RFP當(dāng)中。

圖1 重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV-NLS-CBF-RFP的

2.AAV-293細(xì)胞包裝重組腺相關(guān)病毒:熒光顯微鏡下觀察3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24h后,80%的細(xì)胞表達(dá)紅色熒光蛋白(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染48h后RFP的表達(dá)情況(×100)

3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CBFβ表達(dá)水平:rAAV-NLS-CBFβ-RFP病毒感染MSCs后,利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CBFβ表達(dá)情況,對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組的CBFβ表達(dá)水平明顯升高,這表明rAAV-NLS-CBFβ-RFP病毒已經(jīng)感染MSCs。rAAV-NLS-CBFβ-RFP感染MSCs后第1、2天時(shí),CBFβ的表達(dá)均升高,特別是在48h升高顯著,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。說(shuō)明該方式構(gòu)建的NLS-CBFβ-RFP表達(dá)載體能夠在感染細(xì)胞后能維持較長(zhǎng)的外源性表達(dá)CBFβ的表達(dá)水平。

圖3 CBFβ的mRNA表達(dá)水平(n=3)

討 論

目前尚無(wú)有效抑制骨關(guān)節(jié)炎惡化的治療,最終往往發(fā)展成患者需行關(guān)節(jié)置換術(shù),這給社會(huì)及個(gè)人帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。軟骨損傷會(huì)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展,但由于軟骨缺乏血管,損傷的軟骨再生能力弱[9]。而MSCs作為種子細(xì)胞,具有良好的三系分化能力,目前市場(chǎng)上有商品化的誘導(dǎo)分化劑,其主要為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3,但有研究證明,該誘導(dǎo)分化因子會(huì)引起軟骨細(xì)胞的鈣化、肥大化,難以維持細(xì)胞表型[10]。而KGN分子良好的誘導(dǎo)分化能力,但該分子水溶性差,給藥后會(huì)形成沉淀,導(dǎo)致藥物的有效濃度降低,這限制其誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化的應(yīng)用[8],為優(yōu)化KGN給藥,科研人員開(kāi)發(fā)出了許多途徑,如通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射KGN給藥、構(gòu)建藥物輸送系統(tǒng)、藥物支架等,或通過(guò)聯(lián)合使用其他藥物,均顯示KGN良好的促進(jìn)MSCs成軟骨分化效果[11～18]。此外,近年來(lái)有研究使用工程化外泌體將KGN靶向遞送至間充質(zhì)干細(xì)胞,能取得優(yōu)異的效果[8]。

AAV依賴(lài)于其他病毒(如腺病毒和皰疹病毒)提供的基本輔助功能,以實(shí)現(xiàn)有效的病毒復(fù)制和繁殖,已被成功地用于在體內(nèi)各種組織中建立有效和長(zhǎng)期的基因表達(dá),因此在基因治療研究中起重要的作用,并已經(jīng)形成商業(yè)化的產(chǎn)品[19]。本研究通過(guò)使用KGN促M(fèi)SCs成軟骨分化的下游通路中的關(guān)鍵因子CBFβ,使用腺相關(guān)病毒為載體,成功構(gòu)建了核定位重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體pAAV-NLS-CBFβ-RFP,采用PEI法于AAV-293細(xì)胞中成功包裝出具有感染性的NLS-CBFβ-RFP病毒,為進(jìn)一步研究導(dǎo)入外源性核定位CBFβ后SF-MSCs分化提供了工具。使用重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的核定位CBFβ基因過(guò)表達(dá)是一種比較簡(jiǎn)單的研究方法,將來(lái)可用于骨關(guān)節(jié)炎的基因治療。

核定位信號(hào)是一小段氨基酸序列,早發(fā)現(xiàn)的核定位序列只有7個(gè)氨基酸大小,其主要通過(guò)整合到蛋白結(jié)構(gòu)中,可促進(jìn)蛋白迅速在細(xì)胞核中的積聚[5]。在此后的研究逐漸發(fā)現(xiàn)了其他的核定位序列,雖然長(zhǎng)度有所不同,但有類(lèi)似的特征[20]。核定位信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主要過(guò)程為,其與蛋白形成核孔靶向復(fù)合體,在ATP/GTP存在下,該復(fù)合體與細(xì)胞核表面的核孔復(fù)合體結(jié)合,進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核[21]。因此,在設(shè)計(jì)DNA序列時(shí),加入核定位信號(hào)序列,可成為靶向細(xì)胞核的一種技術(shù)手段,這或許有助于探究藥物或其他分子進(jìn)入細(xì)胞核的研究。

此外,CBFβ是胚胎骨形態(tài)發(fā)生的必要因子,但其在調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、分化以及出生后的軟骨和骨形成的具體機(jī)制尚不清楚。有研究通過(guò)構(gòu)建CBFβ缺乏小鼠模型,發(fā)現(xiàn)了CBFβ缺乏的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松以及大量脂肪細(xì)胞積聚,當(dāng)CBFβ過(guò)表達(dá)時(shí),上述癥狀可被逆轉(zhuǎn),研究結(jié)果證明了CBFβ通過(guò)WNT旁分泌通路發(fā)揮作用以及內(nèi)分泌作用,調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[22]。還有研究發(fā)現(xiàn),CBFβ通過(guò)上調(diào)IHH(Indian hedgehog)通路的表達(dá),抑制甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體(parathyroid hormone-related protein receptor, PPR)在出生后軟骨和骨形成中的表達(dá),控制軟骨細(xì)胞增殖和分化的平衡[23]。但目前仍未有研究能完全闡釋CBFβ在軟骨細(xì)胞的增殖、分化中的機(jī)制。因此,構(gòu)建核定位CBFβ基因的重組腺相關(guān)病毒載體,或許將來(lái)能在間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化研究中發(fā)揮重要作用。