宋東宇,高明宏,李冬梅

0 引言

角膜堿燒傷是比較常見的化學性眼外傷,由于堿具有較強的滲透性,能夠?qū)悄ど顚咏M織造成嚴重的病理性損傷且難以治愈[1]。角膜燒傷的病理損傷進程中會有嚴重的炎癥反應和新生血管生長,大量細胞因子和酶類參與,其中多形核中性白細胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)浸潤和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在病理損傷區(qū)內(nèi)新生血管的生長中發(fā)揮重要作用[2]。角膜堿燒傷的病理損傷機制復雜,對于重度角膜堿燒傷的診治較為棘手,尚無較為理想的治療方法。人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)具有分化增殖快,能力較強、易于制備、易于保存等優(yōu)點[3],目前在角膜堿燒傷的治療中已有應用,但具體的治療機制及療效亟待深入研究,鑒于此,本研究對兔角膜堿燒傷病灶區(qū)進行hUCMSCs移植并觀察角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)生長情況,為臨床治療嚴重角膜堿燒傷提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組選取健康日本白兔75只(首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)實驗中心提供),12月齡,體質(zhì)量2.0～2.5kg,雌雄各半,以右眼為實驗眼,分組前采用裂隙燈檢查排除眼部疾病,依據(jù)體質(zhì)量和性別隨機分為A、B、C組,每組25只,相同飲食及環(huán)境下飼養(yǎng)。三組實驗兔均建立右眼角膜堿燒傷模型。A組兔右眼在堿燒傷后立即行角膜病灶區(qū)羊膜負載hUCMSCs覆蓋術(shù);B組兔右眼在堿燒傷后立即行角膜病灶區(qū)羊膜覆蓋術(shù);C組兔右眼在角膜堿燒傷后未進行處理。本研究遵循國家科技部頒布的《實驗動物管理條例》和中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所編制的《實驗動物安樂死指南》,并獲得首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑和儀器主要試劑:鼠抗兔VEGF多克隆抗體、山羊抗鼠IgG(Abcam),SABC試劑盒、過氧化酶、過氧化酶阻斷劑(Bioss公司),硝酸纖維素濾紙(武漢博士德科技公司)。主要儀器:切片機(HM325,日本)、漂烘處理器(PHY-3,廣州)、恒溫箱(ZD600,泉州)、實驗凈化臺(SW-CJ-IFD,北京)、振蕩器(THZ-82型,沈陽)、分析圖像系統(tǒng)(Image8000,澳大利亞)、裂隙燈(SL-2G,Topcon)、生物顯微鏡(CK×53,Olympus)和ImagePlus6.0分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 兔角膜堿燒傷模型的建立實驗兔右眼表面麻醉(15mL∶75mg鹽酸丙美卡因滴眼液),將浸泡在1mol/L NaOH溶液中的直徑8.0mm的圓形單層濾紙片取出,貼附在角膜中央?yún)^(qū),堿燒傷1min后取下,使用500mL生理鹽水沖洗兔角膜表面和結(jié)膜囊,2.5g/L氯霉素滴眼液及10g/L阿托品滴眼液點眼,制作Ⅲ級角膜堿燒傷動物模型。裂隙燈下觀察角膜燒傷區(qū)透明度、角膜基質(zhì)燒傷深度,依據(jù)中華醫(yī)學會眼外傷學組發(fā)布的燒傷標準進行評估,符合Ⅲ級角膜堿燒傷程度即為模型制作成功[4]。兔右眼角膜堿燒傷造模后,為避免角膜潰瘍穿孔均給予右眼藥物治療,2.5g/L左氧氟沙星滴眼液(每天3次)、10g/L阿托品滴眼液(每天2次)、紅霉素眼膏(每晚1次)點眼,均連續(xù)用藥3d。

1.2.2 羊膜負載hUCMSCs植片的制備本研究應用首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)實驗中心制備的羊膜負載3代hUCMSCs植片成品進行實驗研究,羊膜基質(zhì)的hUCMSCs細胞密度為5000cells/cm2(圖1)。

圖1 第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞 臍帶間充質(zhì)干細胞多為長梭形纖維細胞結(jié)構(gòu),擬負載至羊膜基質(zhì)。

1.2.3 手術(shù)方法實驗兔進行腹腔注射麻醉(4mL濃度為10g/L的戊巴比妥鈉注射液),將頭部固定于顯微鏡下的手術(shù)臺上。A組兔右眼堿燒傷后立即行羊膜負載hUCMSCs植片移植,右眼置開瞼器,20g/L鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉,手術(shù)顯微鏡下以負載hUCMSCs的羊膜上皮面朝上平鋪于角膜表面,在角膜緣將羊膜與結(jié)膜、表層鞏膜用10-0尼龍縫線間斷縫合4針,剪去邊緣多余羊膜。B組兔右眼堿燒傷后立即進行單純羊膜移植,方法同前。C組兔右眼堿燒傷后不做手術(shù)處理。實驗過程中發(fā)生嚴重眼內(nèi)出血或角膜溶解穿孔則予以剔除。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1裂隙燈顯微鏡觀察CNV情況角膜堿燒傷后3、7、14、21、28d,各組隨機選取5只實驗兔,應用裂隙燈檢查右眼,進行眼前節(jié)照相,并對角膜堿燒傷病灶周圍新生血管長入情況進行評分。CNV評分標準:0分:角膜無CNV生長;1分:CNV生長位于角膜緣2mm以內(nèi);2分:CNV位于角膜周邊,范圍≤1/2象限;3分:CNV位于角膜周邊,范圍>1/2象限;4分:全角膜均見CNV生長。

1.2.4.2角膜組織切片的制備角膜堿燒傷后3、7、14、21、28d,各組隨機選取5只實驗兔進行大劑量麻醉處死(經(jīng)耳緣靜脈注射10g/L的戊巴比妥鈉注射液,150mg/kg),立即用手術(shù)剪沿右眼球角膜緣環(huán)形剪開球結(jié)膜,剪斷眼外肌和視神經(jīng),完整摘除眼球,切取帶有少量鞏膜的整個角膜組織,置于10%甲醛溶液中固定48h,之后使用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水,二甲苯溶液透明化切片,石蠟包埋后以4μm厚度進行連續(xù)切片[1]。

1.2.4.3HE染色觀察PMNs浸潤情況隨機選取每只實驗兔角膜組織切片5張,脫蠟后行蘇木素-伊紅(HE)染色,200倍光鏡下觀察每張切片,隨機選取病灶區(qū)的10個視野進行照相,應用Image 8000分析圖像系統(tǒng)和Image Plus6.0分析圖像儀對圖片進行分析,PMNs為細胞核藍色深染,記錄細胞數(shù),取平均值。

1.2.4.4免疫組化染色觀察VEGF的表達隨機選取每只實驗兔角膜組織切片5張,常規(guī)脫蠟,0.3%過氧化氫溶液孵育15min后,修復抗原,血清封閉,滴入稀釋后1∶100濃度的鼠抗兔VEGF多克隆抗體,37℃下孵育1h,加入1∶100濃度的山羊抗鼠IgG和過氧化物酶標SABC溶液,DAB顯色,于400倍顯微鏡下觀察,細胞漿含有棕黃色顆粒的細胞即為VEGF染色陽性細胞[4]。用Image 8000圖像分析系統(tǒng)分析獲得的圖像,在20倍物鏡下輸入圖像采集系統(tǒng),每張切片隨機選取10個視野,獲取VEGF陽性細胞的光密度值,取平均值。

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈顯微鏡觀察CNV情況堿燒傷后即可見到角膜中央?yún)^(qū)有瓷白色邊界清晰的燒傷病灶,病灶直徑約為8mm,深達角膜基質(zhì),窺視不清瞳孔及虹膜組織。隨著損傷進展,角膜緣均見明顯充血,堿燒傷后3d時角膜緣可見毛刷樣新生血管芽;7d時可見CNV長入角膜燒傷區(qū),A組和B組兔眼CNV均呈環(huán)繞式沿病灶邊緣長入基質(zhì)層,B組兔眼CNV生長稍快;14d時A組兔眼角膜病灶周圍存在較大范圍的無CNV長入?yún)^(qū),B組與A組相比病灶區(qū)無CNV生長的面積較小,A組、B組、C組兔眼角膜病灶區(qū)CNV評分分別為0(0,0)、1.50(1.25,1.75)、2.50(2.25,2.92)分,三組總體差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=40.31,P<0.01),A組與B組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);21d時A組兔眼CNV較前期明顯回退;28d時B組兔眼CNV較前期明顯回退,且A組較B組、C組兔眼CNV生長較少,相對應的角膜病灶區(qū)也更加透明(圖2)。

圖2 裂隙燈顯微鏡觀察角膜堿燒傷情況 A:角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后28d;B:角膜堿燒傷單純羊膜移植治療后28d;C:角膜堿燒傷后未處理28d。角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后角膜表面新生血管最少,角膜堿燒傷后未處理角膜表面新生血管最多,角膜透明度最差。

2.2HE染色觀察PMNs浸潤情況堿燒傷后3d時A組和B組兔眼角膜病灶區(qū)損傷明顯較輕,PMNs數(shù)量較少,基質(zhì)層膠原纖維排列清晰平整,羊膜尚未與角膜上皮層融合,較易分離,C組兔眼角膜中央潰瘍,上皮剝脫,病灶區(qū)存在PMNs,基質(zhì)水腫,膠原纖維紊亂;14d時A組和B組羊膜已與角膜上皮基質(zhì)層大部分黏連融合,膠原纖維排列較整齊,水腫較輕,且增厚均勻一致,A組PMNs浸潤和基質(zhì)層中CNV生長均較少,C組兔眼角膜上皮層部分修復,細胞腫脹,基質(zhì)肥厚,膠原纖維斷裂水解,尤其是角膜潰瘍病灶和鄰近病灶的上皮細胞下有大量PMNs浸潤,大量CNV生長,基質(zhì)層膠原纖維明顯紊亂無序(圖3)。

圖3 HE染色觀察PMNs浸潤情況 A:角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后14d;B:角膜堿燒傷單純羊膜移植治療后14d;C:角膜堿燒傷后未處理14d。角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后角膜表面新生血管最少,角膜堿燒傷后未處理角膜表面新生血管最多,角膜基質(zhì)纖維更為紊亂。三角示PMNs;箭頭示新生血管。

角膜堿燒傷后各時間點三組兔角膜PMNs密度隨時間變化波動顯著,堿燒傷后3d時即有大量PMNs產(chǎn)生,7d時有所下降,隨后快速增加并在14d時達到峰值,后逐漸下降,28d時降到接近7d時的量值水平,各時間點組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01,表1)。堿燒傷后3、7、14、21、28d時,A組和B組兔角膜PMNs密度均明顯低于C組(P<0.05),且14、21d時,A組兔角膜PMNs密度均明顯低于B組(P<0.05),但3、7d時,A組和B組兔角膜PMNs密度差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),提示在控制炎癥反應方面羊膜負載hUCMSCs與羊膜覆蓋角膜病灶短期內(nèi)(<7d)的療效無明顯差異,7d后hUCMSCs成活后促進上皮細胞修復,可明顯減少炎癥反應。堿燒傷后28d時(修復后期),A組和B組兔角膜PMNs密度均低于C組(P<0.05),且A組仍低于B組(P>0.05),提示28d時A組和B組兔角膜上皮均已修復,炎癥得到控制。上述結(jié)果表明羊膜負載hUCMSCs移植治療能夠促進角膜上皮較好地修復,療效確切。

表1 兔角膜堿燒傷后各組不同時間點角膜PMNs密度

2.3 免疫組化染色觀察VEGF的表達三組兔角膜堿燒傷后病灶區(qū)均有VEGF陽性表達,堿燒傷后3d時,角膜上皮層缺損,角膜緣CNV和PMNs數(shù)量增多,PMNs周圍VEGF呈弱陽性表達,在角膜病理損傷進程中,VEGF表達逐漸升高,從角膜邊緣到病灶區(qū)中央VEGF表達逐漸升高;7～14d時VEGF分布于角膜上皮和基質(zhì)層,VEGF表達位于PMNs周圍較明顯(圖4);28d時,VEGF在修復的角膜組織中表達很弱。

圖4 免疫組化染色觀察VEGF的表達 A:角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后14d;B:角膜堿燒傷單純羊膜移植治療后14d;C:角膜堿燒傷后未處理14d。角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后角膜基質(zhì)VEGF表達最少,角膜堿燒傷后未處理角膜基質(zhì)VEGF表達最多。細胞漿呈棕黃色為VEGF陽性細胞。

角膜堿燒傷后三組兔角膜中VEGF表達水平均在7～14d時達到峰值,28d明顯降低,各時間點三組組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表2)。堿燒傷后3、7、14、21、28d時,A組和B組兔角膜VEGF表達水平均明顯低于C組(P<0.05),且7、14、21d時,A組兔角膜VEGF表達水平均明顯低于B組(P<0.05)。上述結(jié)果表明羊膜負載hUCMSCs移植治療角膜堿燒傷療效確切。

表2 兔角膜堿燒傷后各組不同時間點角膜中VEGF陽性細胞平均光密度

3 討論

角膜堿燒傷早期潰瘍區(qū)就有大量炎癥細胞浸潤,隨病程進展可見持續(xù)性損傷、角膜上皮剝脫、基質(zhì)水腫潰瘍和CNV生成等,在病理損傷修復進程中炎癥反應和CNV起著重要作用[1,5]。McCulley將眼表化學傷的病程分為4個時期,即燒傷期、急性期(0～7d)、修復早期(1～3wk)和修復晚期(>3wk)[4,6]。本研究涉及角膜燒傷期、急性期、修復早期和修復晚期,堿燒傷后角膜病灶區(qū)的潰瘍修復和堿性物質(zhì)的浸潤損傷進程同時存在。

角膜堿燒傷的治療較為棘手,治療方法很多,其中干細胞移植治療角膜堿燒傷的方法包括hUCMSCs結(jié)膜下注射、骨髓間充質(zhì)干細胞移植和人間充質(zhì)干細胞滴眼液點眼等[7]。Almaliotis等[8]研究向角膜基質(zhì)內(nèi)和結(jié)膜下同時注射間充質(zhì)干細胞,結(jié)果證實間充質(zhì)干細胞具有抑制CNV生長和保持角膜透明度的功能。關(guān)于羊膜負載hUCMSCs移植治療角膜堿燒傷的療效報道較少。Liu等[9]向大鼠角膜基質(zhì)內(nèi)注射hUCMSCs,證實移植的hUCMSCs能在角膜基質(zhì)中成活和增殖,移植的hUCMSCs成功表達角膜基質(zhì)蛋白標記物,角膜基質(zhì)內(nèi)的膠原纖維可以重排,并可增加基質(zhì)厚度、改善角膜透明度,提高角膜基質(zhì)細胞的功能且未誘發(fā)免疫應答,同時Call等[10]和Galindo等[11]將注射hUCMSCs應用于角結(jié)膜損傷治療的研究也獲得了較好的治療效果。本研究移植羊膜負載的hUCMSCs,較角膜基質(zhì)注射更簡單易行,且能對角膜堿燒傷中更大面積的病灶區(qū)進行hUCMSCs移植,從而促進角膜基質(zhì)和上皮修復。以往研究證實間充質(zhì)干細胞能改善角膜透明度,本研究也證實了這一理論。角膜透明度改善的生物機制尚不清楚,分析可能與hUCMSCs調(diào)控成纖維細胞活性和抑制基質(zhì)細胞凋亡等相關(guān)[10,12]。Almaliotis等[8]觀察到成功移植間充質(zhì)干細胞30d后角膜基質(zhì)透明度明顯改善,而本研究移植hUCMSCs 14d后觀察角膜混濁程度已有明顯改善,基質(zhì)混濁減輕,能觀察到虹膜和瞳孔,這可能與羊膜負載的hUCMSCs更易成活并快速發(fā)揮修復作用有關(guān)。

目前關(guān)于CNV生長機制的解釋主要有缺氧理論和炎癥理論,研究認為hUCMSCs移植對角膜堿燒傷后炎癥相關(guān)性血管化具有抑制作用[13]。本研究中,角膜堿燒傷后病灶區(qū)移植hUCMSCs可明顯抑制潰瘍灶周邊CNV的生長,證實移植hUCMSCs具有抑制CNV生長及炎癥反應的雙重作用。羊膜負載hUCMSCs移植可以形成“角膜上皮化”,保護角膜基質(zhì),抑制膠原蛋白酶、鐵蛋白酶及溶解酶的損傷作用,減輕角結(jié)膜炎癥因子的應激反應,hUCMSCs可促進角膜上皮和基質(zhì)層的修復,運送生長因子至潰瘍灶,增強眼表抗炎修復作用,抑制PMNs的深層浸潤,減慢潰瘍進展,促進潰瘍修復。角膜堿燒傷病灶區(qū)既有PMNs浸潤又有VEGF表達,VEGF能夠促進內(nèi)皮細胞分泌蛋白酶及蛋白酶原活化因子,誘導血管基底膜的降解,促進細胞侵入周圍基質(zhì),并遷移、增生和分化成一個新的含有管腔的血管[14-16]。角膜CNV生成的早期,VEGF在角膜緣的表達明顯增加,逐漸向中央潰瘍灶遷移,在PMNs浸潤部位VEGF表達更明顯,可見VEGF的表達與PMNs的浸潤具有一致性。Jiang等[17]在動物實驗中也證實角膜病灶區(qū)VEGF主要來自角膜緣侵入基質(zhì)層的PMNs。吳聯(lián)群等[18]也提出VEGF的表達增強與炎性細胞特別是PMNs的關(guān)系密切,VEGF的表達促進了CNV的生成,這與相關(guān)實驗中利用結(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷抑制PMNs的浸潤,并減少CNV生長的結(jié)果一致[6,19]。本研究各觀察時間點A組和B組角膜PMNs浸潤細胞數(shù)均低于C組,且角膜堿燒傷后14、21d時A組與B組角膜PMNs浸潤量值存在明顯差異,差異具有統(tǒng)計學意義,充分說明角膜堿燒傷后14d前羊膜移植具有治療作用,14d后羊膜負載hUCMSCs移植成活,在促進角膜基質(zhì)和上皮修復方面發(fā)揮了明顯作用;角膜堿燒傷后7、14、21d時A組與B組VEGF的表達量存在明顯差異,差異具有統(tǒng)計學意義,但28d時A組與B組角膜組織VEGF的表達量差異無統(tǒng)計學意義,提示角膜堿燒傷后7d后羊膜負載hUCMSCs移植即發(fā)揮了明顯的修復作用,在實驗晚期(28d時)A組與B組均已完成角膜病灶區(qū)的上皮化,VEGF的表達無明顯差異。本研究結(jié)果為臨床治療角膜堿燒傷的hUCMSCs移植提供了理論依據(jù),為臨床選擇抗炎及抑制血管生成的最佳治療時機提供參考。

根據(jù)本研究中PMNs和VEGF的變化趨勢,角膜堿燒傷后3d眼表即需要頻點抗生素滴眼液,可以稀釋殘留的化學物質(zhì),有效減輕炎癥反應,而7～21d是角膜潰瘍?nèi)芙馄?在抗炎同時要抑制VEGF的活性,減少新生血管的生成,確保角膜透明度。堿燒傷14d后,眼表可以應用促進上皮和基質(zhì)修復的眼膏和眼液,促進修復的同時抑制角膜血管翳[4,6,19-21]。在臨床診治上,炎癥反應和VEGF促進CNV生成關(guān)系密切,角膜堿燒傷的病理損傷和修復過程復雜,炎癥反應與VEGF的相關(guān)性,羊膜負載hUCMSCs移植抑制CNV生長和減輕角膜混濁的機制,尚需實驗深入研究。