張 嬋, 張 靜

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種與新發(fā)高血壓相關(guān)的嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥,其在妊娠中的發(fā)生率為5%～7%,通常在妊娠20周后發(fā)生,如不及時(shí)治療,可能導(dǎo)致母胎發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至死亡[1-2]。盡管已進(jìn)行了大量研究,但PE的病理、生理機(jī)制仍未明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是生物過(guò)程和疾病發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。近期研究表明,PE孕婦胎盤(pán)和循環(huán)血中異常表達(dá)的lncRNA通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞、血管生成、蛻膜和炎癥等生物學(xué)功能參與PE的病理、生理過(guò)程[3]。?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)是一種保守的lncRNA,在多種人類疾病中表達(dá)失調(diào),并與疾病的發(fā)生、發(fā)展具有關(guān)聯(lián)性。據(jù)報(bào)道,lncRNA TUG1在PE進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[4]。微小RNA(microRNA,miRNA)也是生物過(guò)程中的關(guān)鍵因子,胎盤(pán)中異常表達(dá)的miRNA可通過(guò)不同的細(xì)胞通路和作用方式參與PE的發(fā)生和發(fā)展[5]。研究表明,miR-26a調(diào)控妊娠期高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[6]。鑒此,本研究旨在分析lncRNA TUG1和miR-26a在胎盤(pán)組織中的表達(dá)水平,探討其在PE發(fā)生、發(fā)展中的作用,為PE新的診治方法開(kāi)發(fā)提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2019年5月至2021年5月我院產(chǎn)科收治的新發(fā)PE患者100例(PE組),其中輕度PE 49例(輕度PE組),重度PE 51例(重度PE組)。以年齡、胎齡為匹配條件,納入同期健康孕婦100名作為對(duì)照組。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(P20189406),所有受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)PE患者符合第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7]中PE的診斷標(biāo)準(zhǔn),且均為初次診出;(2)單胎妊娠,無(wú)胎兒畸形;(3)臨床資料完整;(4)經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病,有PE家族史;(2)有胎膜早破、母體感染、妊娠期糖尿病等產(chǎn)科并發(fā)癥;(3)合并炎癥疾病;(4)合并免疫功能、凝血功能障礙;(5)通過(guò)輔助生殖技術(shù)受孕者;(6)合并腎、肝等重要臟器疾病。

1.3輕度、重度PE的診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7],輕度PE的診斷標(biāo)準(zhǔn):孕20周后產(chǎn)婦舒張壓≥90 mmHg,收縮壓≥140 mmHg,且24 h尿蛋白≥0.3 g或隨機(jī)尿蛋白(+)。孕產(chǎn)婦出現(xiàn)以下任一情況即確診為重度PE:(1)收縮壓≥160 mmHg,舒張壓≥110 mmHg;(2)血肌酐≥160 μmol/L;(3)乳酸脫氫酶水平升高;(4)血小板<100×109/L;(5)24 h尿蛋白≥5 g,或隨機(jī)尿蛋白(+++)及以上;(6)胎兒生長(zhǎng)受限或羊水過(guò)少;(7)血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高;(8)上腹部疼痛、持續(xù)頭痛或視覺(jué)障礙。

1.4一般臨床資料收集 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者的一般臨床資料,包括年齡、胎齡、分娩前體重指數(shù)(body mass index,BMI)、嬰兒體重、收縮壓、舒張壓和尿蛋白等。收縮壓與舒張壓于分娩前1 d采用電子血壓計(jì)(健太郎HBP-9020)進(jìn)行測(cè)量,重復(fù)測(cè)量3次取平均值。尿蛋白定量:于分娩前1 d

早上8點(diǎn)排空尿液(在近預(yù)產(chǎn)期前囑孕婦每天留尿,只檢測(cè)分娩前1 d的留尿樣本),收集24 h尿液后立即送實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼AU680)進(jìn)行檢測(cè),所用試劑盒為人尿蛋白ELISA試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):YS01757,上海雅吉生物科技有限公司)。

1.5胎盤(pán)組織lncRNA TUG1和miR-26a表達(dá)水平檢測(cè) 在胎盤(pán)娩出后,取胎盤(pán)母體面中央?yún)^(qū)絨毛組織50～80 mg,-80 ℃保存?zhèn)錂z。嚴(yán)格按照TRIzol試劑(貨號(hào):15596026,北京百奧創(chuàng)新科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取胎盤(pán)組織總RNA。應(yīng)用NanoDrop微量分光光度計(jì)(型號(hào):ND-12000,美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)總RNA濃度和純度。取1 μg RNA為模板,通過(guò)PrimeScript RT試劑盒(貨號(hào):RR037A,北京寶日醫(yī)生物有限公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)lncRNA TUG1和miR-26a的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系:10 μl SYBR Green Master Mix、1 μl正向引物(10 μM)、1 μl反向引物(10 μM)、1 μl cDNA和7 μl ddH2O。引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列見(jiàn)表1。使用ABI 7300熒光定量系統(tǒng)按照以下程序進(jìn)行反應(yīng):95 ℃初始變性30 s,40個(gè)循環(huán),95 ℃變性3 s,60 ℃退火30 s,72 ℃ 30 s。每個(gè)樣本重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。以β-actin和U6為內(nèi)參,通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA TUG1和miR-26a的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1三組臨床資料比較 三組年齡、胎齡、分娩前BMI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比,輕度PE組、重度PE組的收縮壓、舒張壓水平更高,其嬰兒體重更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與輕度PE組比較,重度PE組舒張壓、收縮壓、尿蛋白水平均更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組臨床資料比較

2.2三組胎盤(pán)組織lncRNA TUG1和miR-26a表達(dá)水平比較 輕度PE組、重度PE組胎盤(pán)組織的lncRNA TUG1表達(dá)水平低于對(duì)照組,miR-26a表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與輕度PE組比較,重度PE組胎盤(pán)組織lncRNA TUG1表達(dá)水平更低,miR-26a表達(dá)水平更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與輕度PE組比較,bP<0.05

2.3PE患者胎盤(pán)組織lncRNA TUG1、miR-26a表達(dá)水平與血壓及尿蛋白的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,PE患者胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá)水平與收縮壓、舒張壓和尿蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);miR-26a表達(dá)水平與收縮壓、舒張壓和尿蛋白水平呈正相關(guān)(P<0.05)。lncRNA TUG1表達(dá)水平與miR-26a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3,圖2。

表3 PE患者胎盤(pán)組織lncRNA TUG1、miR-26a表達(dá)水平與血壓及尿蛋白Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

圖2 PE患者胎盤(pán)組織lncRNA TUG1和miR-26a表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

3 討論

3.1PE是妊娠期特發(fā)性疾病,是孕產(chǎn)婦圍生期主要的死亡原因之一,終止妊娠是唯一有效的治療措施,且PE對(duì)母體的影響不僅局限于妊娠期,對(duì)孕婦的重要器官均會(huì)帶來(lái)不利影響[8-9]。因此,闡明PE的發(fā)展機(jī)制有助于PE干預(yù)治療策略的開(kāi)發(fā)。多數(shù)研究認(rèn)為,滋養(yǎng)層細(xì)胞的異常分化和凋亡會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙、浸潤(rùn)改變和螺旋動(dòng)脈重構(gòu),胎盤(pán)缺血、缺氧和功能受損,最終導(dǎo)致PE的發(fā)生[10]。最近的研究表明,一些lncRNA在PE患者的胎盤(pán)中異常表達(dá),例如,lncRNA SH3PXD2A-AS1可調(diào)節(jié)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡,可能與PE的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11]。lncRNA TUG1位于人22 q12.2染色體上,其可能與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和耐藥性相關(guān)[12]。不少研究顯示,lncRNA TUG1在PE患者的胎盤(pán)組織中表達(dá)下調(diào),對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成具有抑制作用[13]。Li等[4]發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1可通過(guò)調(diào)控miR-29b促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成。Yu等[14]提出lncRNA TUG1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-204-5p增加滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲,提示lncRNA TUG1與PE的發(fā)病機(jī)制有關(guān),可能是滋養(yǎng)層細(xì)胞生物行為的調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示,PE患者胎盤(pán)組織lncRNA TUG1表達(dá)下調(diào),且與輕度PE患者相比,重度PE患者的lncRNA TUG1的表達(dá)水平更低。高血壓和高尿蛋白是PE的主要臨床特征,可在一定程度上反映PE的嚴(yán)重程度,本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1的表達(dá)水平與收縮壓、舒張壓和尿蛋白呈負(fù)相關(guān),證實(shí)了lncRNA TUG1的表達(dá)水平與PE患者的臨床嚴(yán)重程度有關(guān),結(jié)果提示lncRNA TUG1在PE的發(fā)生、發(fā)展上發(fā)揮了一定的作用。

3.2miRNA在多種生理和病理途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用,且miRNA的異常表達(dá)與妊娠相關(guān)疾病有關(guān)。有研究表明,miRNA可通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲,參與PE的發(fā)生[15]。據(jù)報(bào)道,缺氧可誘導(dǎo)miR-26的表達(dá),在多細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[16]。miR-26a是miR-26家族的成員,參與基因表達(dá)調(diào)控,并參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物過(guò)程,被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]。董麗宏等[6]研究發(fā)現(xiàn),妊娠期高血壓疾病孕婦血漿中miR-26a表達(dá)水平顯著高于正常孕婦,且過(guò)表達(dá)miR-26a能夠抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)凋亡。miR-26a-5p是miR-26a的成熟片段,Yang等[18]研究顯示,miR-26a-5p在PE患者胎盤(pán)組織和血漿中表達(dá)上調(diào),且過(guò)表達(dá)miR-26a-5p亦可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究中,PE患者胎盤(pán)組織中miR-26a表達(dá)水平上調(diào),與上述研究結(jié)果一致,提示miR-26a可能參與了PE的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-26a表達(dá)水平與PE的嚴(yán)重程度相關(guān)。

3.3lncRNA可以作為miRNA“海綿”,通過(guò)靶向下游miRNA參與疾病的發(fā)生,且具有競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA的作用。研究顯示,lncRNA TUG1可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合多個(gè)miRNA[19],其上調(diào)表達(dá)可抑制miR-26a表達(dá),而沉默lncRNA TUG1可促進(jìn)miR-26a表達(dá)[20]。本研究結(jié)果也顯示,PE患者胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA TUG1的表達(dá)水平與miR-26a呈負(fù)相關(guān),推測(cè)lncRNA TUG1可能通過(guò)與miR-26a靶向結(jié)合參與PE的病理過(guò)程,這有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述,lncRNA TUG1在PE胎盤(pán)組織中呈低表達(dá),而miR-26a呈高表達(dá)。lncRNA TUG1可能通過(guò)靶向結(jié)合miR-26a在PE的發(fā)生中發(fā)揮作用,這為PE治療策略的開(kāi)發(fā)提供了參考。