張 超

（開封市中醫(yī)院，河南 475000）

八珍益母丸收載于《中國藥典》2020 版，具有益氣養(yǎng)血、活血調(diào)經(jīng)的功效，用于氣血兩虛兼有血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)，癥見月經(jīng)周期錯后、行經(jīng)量少、淋漓不凈、精神不振、肢體乏力［1］。明·張景岳《景岳全書》中記載，八珍益母丸主治血氣兩虛，月經(jīng)不調(diào)。明·葉文齡的《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》中記載，八珍益母丸補氣血，調(diào)月經(jīng)［2-3］。本試驗首次建立了HPLC-CAD 法同時測定八珍益母丸中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿和豬苓酸C 3 種有效成分的方法，所建立的分析方法簡單、靈敏度高、專屬性好，可應(yīng)用于八珍益母丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀，配置Corona Veo 電霧式檢測器（變色龍工作站，美國賽默飛公司）；BSA124S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-5000 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 鹽酸水蘇堿對照品（批號110712-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）、鹽酸益母草堿對照品（批號111823-201704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；豬苓酸C 對照品（批號20210902，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）購于上海百悅生物技術(shù)有限公司；水為超純水，甲醇、乙腈均為色譜純（美國Fisher 公司），其他試劑均為分析純。八珍益母丸（長春新安藥業(yè)有限公司，批號20220801、20220805、20220807）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-Phenyl 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，10 mmol/L 甲酸銨（甲酸調(diào)pH 值至4.0）為流動相B，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫35 ℃，流速1 ml/min，進樣量10 μl。CAD 霧化器溫度35 ℃，過濾常數(shù)為5.0，采集頻率為10 Hz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 對照品適量，加甲醇制備成含鹽酸水蘇堿550 μg/ml、鹽酸益母草堿450 μg/ml 與豬苓酸C 12 μg/ml 的對照品母液，分別精密取對照品母液適量，置于同一量瓶中，加甲醇配制不同濃度的對照品溶液，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得系列混合對照品溶液，見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 混合對照品系列濃度溶液 μg/ml

2.2.2 供試品溶液的制備 取大蜜丸，剪碎，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）30 min，放至室溫，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液1 ml，置5 ml 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按工藝同法制成缺益母草和茯苓的陰性樣品，分別按“2.2.2”項下方法制成的陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，陰性對照溶液在與對照品和樣品溶液相應(yīng)的位置上無干擾，見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）高效液相色譜圖

2.4 線性范圍 取“2.2.1”項下系列混合對照品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進行方程回歸，結(jié)果鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 在以下線性范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，見表3。

表3 含量測定回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，依“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，記錄鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 峰面積，RSD 分別為2.26%、1.38%和3.18%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號20220801），分別在第0、2、4、6、8、12、18、20 和24 h依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 峰面積，RSD 分別為1.92%、1.54%和1.44%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取八珍益母丸6 份（批號20220 801），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 峰面積，測得八珍益母丸中鹽酸水蘇堿含量0.689 mg/g、鹽酸益母草堿0.592 mg/g、豬苓酸C 0.158 mg/g，RSD 分別為1.23%、1.62%和2.82%，均小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 耐用性考查 取同一樣品（批號20220801），按照“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析。分別對色譜條件的微小變化進行考查，包括柱溫、流速、色譜柱等對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，色譜條件的微小變化對樣品的測定基本沒有影響，表明方法的耐用性好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量樣品1 g（批號20220801），精密稱重，分別精密加入低、中、高濃度的對照品溶液各3 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率，鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿、豬苓酸C平均加樣回收率分別為99.39%（RSD 為0.98%）、98.84%（RSD 為0.94%）和100.11（RSD 為1.09%），平均加樣回收率為98%～102%，RSD≤2.0%。結(jié)果見表4-6。

2.10 含量測定 取3 批八珍益母丸（批號分別為20220801、20220805、20220807），按照“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 含量，結(jié)果見表7。

表4 鹽酸益母草堿加樣回收率試驗結(jié)果

表5 鹽酸水蘇堿加樣回收率試驗結(jié)果

表6 豬苓酸C 加樣回收率試驗結(jié)果

表7 含量測定結(jié)果（n=3）mg/g

3 討論

八珍益母丸由益母草、熟地黃、當(dāng)歸、黨參、炒白術(shù)、酒白芍、川芎、茯苓與甘草9 味中藥組成，方中重用益母草，活血化瘀，調(diào)經(jīng)止痛，為君藥；熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎養(yǎng)血活血；黨參、白術(shù)、茯苓、甘草益氣健脾，共為臣藥；諸藥合用，消補兼施，益氣養(yǎng)血，活血調(diào)經(jīng)。

文獻中對于該中成藥的質(zhì)量研究均為基于多指標(biāo)成分的含量測定，有HPLC-UV 法［4］、HPLC-ELSD法［5］、HPLC-MS［6］等。由于HPLC-MS 的儀器成本高，HPLC-ELSD 法的靈敏度低，HPLC-UV 法對于無紫外吸收物質(zhì)檢測的局限性，本試驗嘗試采用電霧式檢測器［7］（CAD）對于該中成藥中紫外吸收較弱的成分進行研究。

本試驗對供試品的提取方式進行了考查，提取方式包括超聲提取和索氏提取，試驗證明超聲提取就可以滿足需要。同時對于提取溶劑進行了考查，如乙醇、甲醇、不同比例的乙醇水溶液等，優(yōu)選70%的乙醇水溶液。最后，對于提取時間進行了考查，考查的提取時間包括10、20、30、40 和50 min，優(yōu)選30 min，最終確定了供試品的提取條件。

本試驗對于色譜條件進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，由于CAD 檢測器對于流動相的要求，流動相中僅可添加揮發(fā)性的添加劑，因此對于甲酸銨體系、乙酸銨體系、甲醇體系、乙腈體系分別進行了考查，甲酸銨體系的基線更好，優(yōu)選甲酸銨體系。同時對于不同填料的色譜柱進行了考查，包括苯基柱、C8柱、C18柱等，優(yōu)選苯基柱，在此基礎(chǔ)上對方法進行了優(yōu)化。最后對確定的方法進行了系統(tǒng)的驗證，方法學(xué)考查結(jié)果良好，故本文采用該方法作為八珍益母丸3 種指標(biāo)成分的含量測定方法。

綜上可見，HPLC-CAD 法測定鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與豬苓酸C 的含量，測定結(jié)果準(zhǔn)確、操作方便，可用于八珍益母丸的質(zhì)量控制，可為八珍益母丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考和依據(jù)。