黃旭平 黃菊芳 黎敏航 楊 爽 羅偉生

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西南寧市 530011; 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣西南寧市 530001)

胃癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1],根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的調(diào)查,2020年全球新增癌癥病例1 930萬(wàn)例,其中胃癌占5.7%,胃癌的新增病例數(shù)和死亡病例數(shù)在所有癌癥中分別位居第5、第3[2]。據(jù)GLOBOCAN 2020統(tǒng)計(jì),2020年我國(guó)胃癌新增病例約478 508例(男性331 629例,女性146 879例),位居全球第一,約有373 789人死于該病[2]。多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已錯(cuò)過(guò)手術(shù)根治時(shí)機(jī),因此新輔助化療成為中晚期胃癌的重要治療手段,盡管經(jīng)新輔助化療后患者總生存期有所改善,但仍然存在較高的復(fù)發(fā)率[3]。研究顯示,人表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)家族由HER1[編碼HER1蛋白或表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)]、HER2(編碼HER2蛋白)、HER3(編碼HER3蛋白)和HER4(編碼HER4蛋白)4個(gè)密切相關(guān)的成員組成,是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件,可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、遷移、黏附、修復(fù)和血管再生等過(guò)程,在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用[4]。HER家族成員在胃癌中往往過(guò)度表達(dá)與激活,尤其是EGFR和HER2[5]。HER家族蛋白形成自二倍體或異二倍體后,主要通過(guò)激活下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號(hào)通路,來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[6-7]。因此推測(cè)HER信號(hào)通路是治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn),如針對(duì)HER2的曲妥珠單抗已被證實(shí)可顯著改善HER2陽(yáng)性胃癌患者的預(yù)后[8]。故本研究選取人胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS進(jìn)行體外研究,觀察七方胃痛顆粒對(duì)AGS細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響,以及對(duì)HER信號(hào)通路和下游PI3K/AKT信號(hào)通路的影響,為七方胃痛顆粒的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 AGS細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)院。使用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)AGS細(xì)胞。

1.2 主要試劑及儀器 七方胃痛顆粒組方包括紅參10 g、白術(shù)10 g、生黃芪30 g、茯苓10 g、炙甘草9 g、白芍30 g、炒雞內(nèi)金10 g、枳實(shí)12 g、木香6 g、黃連6 g、吳茱萸3 g、丹參10 g,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院制劑室將免煎中藥顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))混勻后滅菌包裝,每小袋8 g。順鉑(Sigma-Aldrich Lab &Product Materials公司,批號(hào):MKCM2345),胎牛血清(Gibco公司,批號(hào):10099242C),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司,批號(hào):C11873600CP),青霉素和鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20200119、20191108)。Annexin Ⅴ-APC/7-ADD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào):20201019),細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào):20191225),Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批號(hào):11141ES60],Hieff ? qPCR SYBR? Green Master Mix(No Rox)[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批號(hào):11184ES08],RIPA高效裂解液和蛋白酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20200525、20200110),辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物有限公司,批號(hào):C0919)。EGFR抗體(批號(hào):AB52894)、HER2抗體(批號(hào):AB134182)、HER3抗體(批號(hào):AB32121)、HER4抗體(批號(hào):AB32375)、AKT抗體(批號(hào):AB179463)、PI3K抗體(批號(hào):AB32089)、β-actin抗體(批號(hào):AB8227)均購(gòu)自Abcam公司。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司,型號(hào):JS-380),K2800核酸分析儀(北京凱奧科技發(fā)展有限公司),流式細(xì)胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號(hào):BD Calibur),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司,型號(hào):ABI 7500)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 七方胃痛顆粒含藥血清的制備:取20只健康清潔級(jí)SD大鼠[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2020-0002;體重(200±10)g,均為雄性],適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周。大鼠每日的七方胃痛顆粒用量按成人劑量的0.018倍計(jì)算[9]。將七方胃痛顆粒用生理鹽水稀釋,配制成濃度為2 g/mL的七方胃痛顆?；鞈胰芤?然后給予大鼠灌胃處理,劑量為1 mL/100 g,2次/d,連續(xù)灌胃5 d,末次灌胃結(jié)束后禁食1 h,然后在無(wú)菌條件下從腹腔采集靜脈血5 mL,靜置3～4 h后,4 ℃下3 000 r/min離心20 min,超凈臺(tái)上分離血清,將分離得到的血清置于56 ℃水浴中30 min滅活,用0.22 μm濾器過(guò)濾,-70 ℃冷藏備用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)將血清加入RPMI-1640培養(yǎng)基中,分別配制成含100 mL/L、200 mL/L、300 mL/L (即10%、20%、30%)藥物血清的培養(yǎng)基。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞接種到6孔板中,2 mL/孔,每孔約含3×105個(gè)細(xì)胞。將AGS細(xì)胞隨機(jī)分為5組[空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(順鉑組)、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組]。將各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,棄去舊培養(yǎng)基,使用PBS清洗2次?？瞻讓?duì)照組加入1 mL RPMI-1640溶液,各含藥血清組分別加入1 mL對(duì)應(yīng)濃度含藥血清,陽(yáng)性對(duì)照組加入1 mL濃度為4 μg/mL的順鉑[10]。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期:(1)細(xì)胞凋亡檢測(cè)。取1.3.2干預(yù)后的各組細(xì)胞,加入0.5 mL 0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)消化約30 s后收集至離心管中。加入適量PBS輕柔清洗2次,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后,將其密度調(diào)整為約1×106個(gè)細(xì)胞/mL。取0.5 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管內(nèi),37 ℃下1 500 r/min離心5 min后加入500 μL Binding buffer重懸,再加入5 μL Annexin Ⅴ-APC及5 μL 7-AAD,輕柔吹勻后室溫下避光反應(yīng)10 min后,將樣本放置在冰上避光保存,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,并采用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率。其中Annexin Ⅴ-APC(-)/7-ADD(+)為壞死細(xì)胞,主要是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生機(jī)械損傷的細(xì)胞,不納入計(jì)算;Annexin Ⅴ-APC(+)/7-ADD(+)為中晚期凋亡細(xì)胞;Annexin Ⅴ-APC(+)/7-ADD(-)為早期凋亡細(xì)胞;Annexin Ⅴ-APC(-)/7-ADD(-)為未發(fā)生凋亡細(xì)胞。總凋亡率=早期凋亡細(xì)胞率+中晚期凋亡細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(2)細(xì)胞周期檢測(cè)。取1.3.2干預(yù)后的各組細(xì)胞,加入0.5 mL 0.25%胰酶消化約30 s后收集至離心管中,加入適量PBS輕柔清洗2次,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后,將其密度調(diào)整為約1×106個(gè)細(xì)胞/mL。取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管內(nèi),4 ℃下1 500 r/min離心5 min后棄上清液,加入500 μL預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞,4 ℃冰箱過(guò)夜。4 ℃下1 500 r/min離心5 min后收集細(xì)胞,使用PBS洗滌細(xì)胞2次后, 再次4 ℃下1 000 r/min離心3 min。然后加入500 μL PBS(含50 μg/mL溴化丙錠,100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100,預(yù)先配置),4 ℃避光孵育30 min。按照標(biāo)準(zhǔn)程序,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm處的熒光反應(yīng),采用ModFit軟件分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況:采用RIPA高效裂解液裂解1.3.2干預(yù)后的各組細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,采用K2800核酸分析儀測(cè)定蛋白含量。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶常溫封閉1.0～1.5 h,使用PBST洗滌3次,5 min/次。然后加入β-actin(1 ∶10 000)、EGFR(1 ∶10 000)、HER2(1 ∶1 000)、HER3(1 ∶1 000)、HER4(1 ∶10 000)、AKT(1 ∶10 000)、PI3K(1 ∶1 000)抗體(均為1 μL),4 ℃過(guò)夜。使用PBST洗滌3次,5 min/次,然后加入1 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000),常溫下脫色搖床搖1 h,PBST洗滌3次,5 min/次。采用二氨基聯(lián)苯胺顯色,凝膠成像系統(tǒng)成像拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)水平:使用TRIzol法提取1.3.2干預(yù)后的各組細(xì)胞總RNA,測(cè)定其純度后,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系包括Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox) 10 μL、上游引物 (10 μmol/L)0.4 μL、下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、cDNA 2 μL、無(wú)酶水7.2 μL,總共20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(共40個(gè)循環(huán))。以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△CT法計(jì)算各基因mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 七方胃痛顆粒對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響 與空白對(duì)照組相比,順鉑組AGS細(xì)胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均升高,20%含藥血清組AGS細(xì)胞的中晚期凋亡率升高,30%含藥血清組AGS細(xì)胞的中晚期凋亡率及總凋亡率升高(均P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 5組AGS細(xì)胞凋亡情況

表2 5組AGS細(xì)胞凋亡率的比較(x±s,%)

2.2 七方胃痛顆粒對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響 與空白對(duì)照組相比,其他各組細(xì)胞的G0/G1期比例升高、S期比例降低,且順鉑組細(xì)胞的G2/M期比例降低(均P<0.05),而10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組的G2/M期比例與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

圖2 5組AGS細(xì)胞周期變化情況

表3 5組AGS細(xì)胞周期的比較(x±s,%)

2.3 七方胃痛顆粒對(duì)HER信號(hào)通路及下游PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,順鉑組AGS細(xì)胞的EGFR、HER2、HER3、HER4、AKT、PI3K蛋白表達(dá)水平均下降,10%含藥血清組AGS細(xì)胞的HER4蛋白表達(dá)水平下降,20%含藥血清組AGS細(xì)胞的EGFR、HER4蛋白表達(dá)水平均下降,30%含藥血清組AGS細(xì)胞的EGFR、HER2、HER3、HER4、AKT、PI3K蛋白表達(dá)水平均下降(均P<0.05)。見(jiàn)圖3和表4。

圖3 5組AGS細(xì)胞中HER信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表4 5組AGS細(xì)胞HER信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 七方胃痛顆粒對(duì)HER信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比,順鉑組、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組AGS中的EGFR、HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT的mRNA表達(dá)水平均下降(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 5組AGS細(xì)胞HER信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,絕大多數(shù)胃癌屬于腺癌,早期可出現(xiàn)上腹脹滿(mǎn)不適、噯氣反酸、燒心感等非特異性消化道癥狀,因與胃炎、胃潰瘍等疾病的臨床癥狀相似,易被忽略。中醫(yī)將胃癌納入“胃脘痛”“痞滿(mǎn)”“噎膈”“反胃”等范疇。《金匱要略》記載“朝食暮吐,暮食朝吐,宿谷不化,名曰胃反”,這與胃癌晚期幽門(mén)梗阻的癥狀較為相似?！稘?jì)生方》描述“伏梁之狀,起于臍下,其大如臂,上至心下,猶梁之橫架于胸膈者,是為心積……其病腹熱而赤,甚則吐血,令人食少饑瘦”,這與胃癌中期出現(xiàn)的胃痛、食少、嘔血、消瘦及癌腫的癥狀相似。西醫(yī)認(rèn)為胃癌與飲食、幽門(mén)螺桿菌感染、遺傳等因素有關(guān)[11]。中醫(yī)認(rèn)為胃癌與外因、內(nèi)因均相關(guān),常因寒溫不適、飲食失調(diào)、脾胃損傷、憂(yōu)思郁結(jié)、肝失疏泄、脾失健運(yùn)、胃失和降、日久交阻、濕熱互結(jié)、氣滯血瘀而致癌。由于病期早晚不同,所表現(xiàn)癥狀不同,在治療上應(yīng)重視辨證與辨病、扶正與驅(qū)邪、局部與整體相結(jié)合的原則[12]。

羅偉生教授結(jié)合胃癌的病因、病機(jī)及個(gè)人長(zhǎng)期臨床實(shí)踐,創(chuàng)制七方胃痛顆粒,該方結(jié)合了7個(gè)經(jīng)典方劑的特點(diǎn),取四君子湯之健脾益氣、丹參飲之活血化瘀、左金丸之清肝瀉火、逍遙散之疏肝解郁、枳實(shí)芍藥散之行氣活血、枳術(shù)丸之健脾消痞、木香檳榔丸之行氣導(dǎo)滯,縱觀全方,肝脾胃同治,同時(shí)活血化瘀、行氣導(dǎo)滯、清蘊(yùn)結(jié)濁毒,降胃腑之濁氣,利脾胃之氣[13]。既往研究顯示,該方不僅能夠抑制AGS細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14],通過(guò)影響SGC-7901細(xì)胞的Fas/FasL通路促進(jìn)其凋亡[15],還可以顯著降低胃癌Wistar大鼠的病死率[16]。但其抗癌作用的分子生物學(xué)機(jī)制尚無(wú)詳細(xì)研究。本研究結(jié)果顯示,七方胃痛顆粒20%含藥血清、30%含藥血清能提高AGS細(xì)胞的中晚期凋亡率(P<0.05),說(shuō)明七方胃痛顆粒對(duì)AGS細(xì)胞具有一定的促凋亡作用。

研究表明,EGFR在多種惡性腫瘤細(xì)胞的表面過(guò)表達(dá),能通過(guò)多種途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲,是治療胃癌的重要靶點(diǎn),同時(shí)也是療效分析及預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物[17]。腫瘤組織中的一些蛋白因子(如表皮生長(zhǎng)因子等)可激活EGFR,活化的EGFR可激活其下游信號(hào)通路(如PI3K/AKT信號(hào)通路)[18],促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和分化,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和腫瘤血管形成[19]。從本研究結(jié)果可以看出,一定濃度的七方胃痛顆粒含藥血清能直接減少AGS細(xì)胞中EGFR基因的轉(zhuǎn)錄,降低其蛋白的表達(dá),從源頭上抑制該信號(hào)通路的激活。HER2是重要的原癌基因,在胃的癌前病變中其表達(dá)水平明顯升高[20],其編碼產(chǎn)物在與自身或其他HER家族蛋白(如HER3等)結(jié)合形成同源或異源二倍體后,可進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路(如PI3K/AKT信號(hào)通路)[21],抑制細(xì)胞凋亡及加速細(xì)胞周期,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示,給予七方胃痛顆粒含藥血清干預(yù)后,AGS細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期,而HER2、PI3K、AKT的蛋白表達(dá)水平及基因轉(zhuǎn)錄水平均降低,說(shuō)明七方胃痛顆粒具有抑制AGS細(xì)胞增殖的作用,作用機(jī)制可能是七方胃痛顆粒通過(guò)抑制HER2的同源或異源二倍體的形成,從而無(wú)法激活下游PI3K/AKT信號(hào)通路。HER3在胃癌組織中常過(guò)度表達(dá),已被證實(shí)對(duì)胃癌的進(jìn)程起到重要作用[22]。本研究結(jié)果顯示,七方胃痛顆粒30%含藥血清可下調(diào)AGS細(xì)胞的HER3蛋白表達(dá)水平(P<0.05),且各濃度的七方胃痛顆粒含藥血清均使得AGS細(xì)胞的HER3基因轉(zhuǎn)錄水平降低(P<0.05),提示七方胃痛顆?？赡芡ㄟ^(guò)下調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而減少AGS細(xì)胞內(nèi)HER通路相關(guān)蛋白的表達(dá),從而起到調(diào)控HER信號(hào)通路的作用。HER4由HER4基因編碼,其通過(guò)自體磷酸化參與細(xì)胞信號(hào)的傳遞,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂。HER4在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥等中發(fā)揮重要作用,促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展,與胃癌預(yù)后密切相關(guān)[23]。在本研究中,七方胃痛顆粒含藥血清干預(yù)后,AGS細(xì)胞的HER4蛋白和mRNA 的表達(dá)水平均降低,說(shuō)明調(diào)控HER4的表達(dá)可能也是七方胃痛顆粒治療胃癌的機(jī)制之一。

綜上所述,七方胃痛顆粒能促使AGS細(xì)胞發(fā)生中晚期凋亡,使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,其可能通過(guò)抑制HER信號(hào)通路及下游PI3K/AKT信號(hào)通路的激活,抑制AGS的增殖。