周文煜 陳文莉 甘文淵 申江曼

(1 華中科技大學同濟醫(yī)學院武漢中心醫(yī)院腎病風濕科,湖北省武漢市 430014; 2 武漢市第四醫(yī)院血液風濕科,湖北省武漢市 430030)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是臨床上較為常見的一種自身免疫疾病,以進行性骨損傷、慢性炎癥為主要臨床特征,病變可累及四肢關節(jié),引起關節(jié)畸形,造成關節(jié)功能障礙[1-2]。研究發(fā)現,RA的發(fā)病與機體內免疫失衡、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表達失調、微生物感染、miRNA異常表達、炎癥反應等有關[3-4]。有研究顯示,lncRNA?；撬嵘险{基因1(lncRNA taurine up-regulated gene 1,lncRNA TUG1)在RA的成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)中表達上調,其可能通過影響FLS葡萄糖代謝及細胞凋亡進而影響RA的病理進程,lncRNA TUG1可能是診治RA的潛在靶標[5]。此外,miR-199a-3p在RA的FLS中呈低表達,其可通過抑制FLS增殖、誘導FLS凋亡來參與RA的發(fā)生和發(fā)展,提示miR-199a-3p亦可能是RA的治療靶點[6]。Li等[7]研究發(fā)現lncRNA TUG1可通過靶向結合miR-199a-3p促進尤文肉瘤細胞增殖、侵襲,但lncRNA TUG1、miR-199a-3p在RA中的相關性及二者與RA疾病嚴重程度的關系尚未明確。因此,本研究通過測定RA患者血清miR-199a-3p、lncRNA TUG1的表達水平,分析二者相關性及其與RA疾病嚴重程度的關系,為臨床評估RA疾病嚴重程度提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2021年11月華中科技大學同濟醫(yī)學院武漢中心醫(yī)院收治的102例RA患者作為RA組,納入標準:(1)符合《2018中國類風濕關節(jié)炎診療指南》中的RA診斷標準[8],且為首次確診;(2)年齡30～70歲。排除標準:(1)合并高血壓、強直性脊柱炎者;(2)合并糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡者;(3)合并腫瘤、特發(fā)性血小板減少性紫癜者;(4)合并腎功能異常、嚴重感染者;(5)合并血液系統(tǒng)疾病或其他自身免疫系統(tǒng)病變者;(6)臨床資料不全者。納入同期在本院體檢的健康者102例作為健康組,納入標準:無RA或其他關節(jié)炎病史。排除標準:近期合并其他部位感染者。RA組中男性40例、女性62例,年齡30～70(53.28±13.12)歲;健康組中男性44例、女性58例,年齡30～70(54.73±13.60)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。研究對象或其家屬對本研究知情同意,本研究經華中科技大學同濟醫(yī)學院武漢中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 收集指標及其方法

1.2.1 血液樣本收集:收集RA患者入院時及健康者體檢當日清晨空腹外周靜脈血5～6 mL,4 ℃下放置約30 min使其自然凝集,4 ℃、5 500 r/min離心5 min,取上層血清,分裝,于-70 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實時熒光定量PCR法檢測血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表達水平:取適量血清解凍,使用TRIzol? LS Reagent(Ambion公司,型號:10296-010)提取總RNA,使用分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司,型號:NanoDrop One)檢測RNA濃度及純度;使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,型號:R111-02)制備cDNA;通過SYBR? Green Real-Time PCR Master Mix試劑盒[AMS Biotechnology (Europe) Limited,貨號:AMS.AVP005-34]、實時熒光定量PCR儀(ABI公司,型號:StepOneTM)擴增cDNA,獲取檢測指標循環(huán)閾值(CT值)。反應體系包括cDNA 1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、上游和下游引物各1 μL,加ddH2O 至總體積為20 μL。擴增反應為96 ℃預變性4 min,94 ℃ 變性30 s、58 ℃退火15 s、60 ℃延伸15 s(共40個循環(huán))。lncRNA TUG1以GAPDH為內參,miR-199a-3p以U6為內參,各引物序列見表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以2-ΔΔCt法計算lncRNA TUG1、miR-199a-3p相對表達水平。

表1 lncRNA TUG1、GAPDH、miR-199a-3p、U6引物序列

1.2.4 血清類風濕因子水平及血沉檢測:取適量血清,以免疫比濁法檢測血清類風濕因子水平,并利用血細胞分析儀(Beckman Coulter Life Science公司,UniCel? DxH800)依據魏氏法檢測血沉。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數資料以例數(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗;正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗;采用Pearson檢驗進行變量的相關性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 RA組和健康組血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表達水平的比較 與健康組相比,RA組患者血清lncRNA TUG1表達水平升高,血清miR-199a-3p表達水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 RA組和健康組血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p相對表達水平的比較(x±s)

2.2 不同疾病活動度RA患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p、類風濕因子水平及DAS28-CRP、血沉的比較 低活動組、中活動、高活動組RA患者的血清lncRNA TUG1表達水平、血清類風濕因子水平、DAS28-CRP及血沉均依次升高,而血清miR-199a-3p表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 不同疾病活動度RA患者DAS28-CRP及血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p、類風濕因子水平,血沉的比較 (x±s)

2.3 RA患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表達水平與疾病嚴重程度評價指標的相關性 RA患者血清lncRNA TUG1表達水平與DAS28-CRP、血清類風濕因子水平及血沉均呈正相關,血清miR-199a-3p表達水平與DAS28-CRP、血清類風濕因子水平及血沉均呈負相關(均P<0.05)。見表4。

表4 RA患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表達水平與疾病嚴重程度評價指標的相關性

2.4 RA患者血清lncRNA TUG1表達水平與血清miR-199a-3p表達水平的相關性 RA患者血清lncRNA TUG1表達水平與血清miR-199a-3p表達水平呈負相關(r=-0.586,P<0.001)。

3 討 論

RA是一種以滑膜炎為病理基礎的免疫性疾病,其可伴有關節(jié)疼痛、腫脹、晨僵等癥狀,難以治愈,若不及時正確評估患者病情并給予正規(guī)治療,可造成關節(jié)功能障礙,影響患者正常生活能力[10]。由于RA早期臨床表現缺乏特異性,癥狀較為復雜多樣,因此難以準確判斷RA患者的病情嚴重程度。尋找可評估RA疾病嚴重程度的指標,及時制訂對應干預措施,對于改善RA患者的生存質量具有積極意義。研究顯示,DAS28-CRP可用于評估RA的疾病活動度[9]。類風濕因子是診斷和評估RA的敏感指標。另外,當機體存在炎癥時,紅細胞易聚集,血沉升高,所以血沉也是目前臨床上用于評估RA疾病活動度的指標之一[11]。故本研究選用血清類風濕因子水平、血沉、DAS28-CRP作為評估RA疾病嚴重程度的指標。

lncRNA在炎癥反應、免疫平衡、信號轉導等過程中發(fā)揮重要調控作用[12-13]。研究發(fā)現,RA患者滑膜組織中l(wèi)ncRNA Gm15621表達水平降低,并通過調控相關信號軸抑制炎癥反應來參與RA發(fā)生和發(fā)展[14]。另外,lncRNA轉移相關肺腺癌轉錄本1在RA中呈低表達,通過影響NOTCH信號通路參與RA發(fā)病過程[15]。以上研究表明了RA發(fā)生和發(fā)展與lncRNA表達失調密切相關,探究RA相關lncRNA的表達及作用機制或許可以為RA的臨床診治提供新線索。lncRNA TUG1作為lncRNA的一員,在多發(fā)性骨髓瘤患者中呈高表達,且與患者預后相關,lncRNA TUG1可能可以作為診斷多發(fā)性骨髓瘤的輔助手段[16]。另外,研究發(fā)現lncRNA TUG1在骨關節(jié)炎的軟骨樣本中表達上調,通過調節(jié)軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解來影響骨關節(jié)炎病理變化過程,lncRNA TUG1可能是治療骨關節(jié)炎的靶標[17]。本研究中RA患者血清lncRNA TUG1表達水平較健康人群升高,這與Zhang等[5]的研究結果相似。此外,RA患者血清lncRNA TUG1表達水平隨RA疾病活動度增加而升高,且與DAS28-CRP、血清類風濕因子水平、血沉均呈正相關,提示lncRNA TUG1可能參與了RA的病情發(fā)展過程,與RA疾病嚴重程度關系密切。lncRNA TUG1有望成為臨床評估RA患者病情的潛在標志物,但目前相關作用機制尚不明確,推測上調的lncRNA TUG1可能通過調控有關信號通路,參與ECM降解[17],影響炎癥反應,進而促進RA的病理進展。

miRNA可參與炎癥反應、介導自噬,影響細胞凋亡過程,與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、RA等密切相關[18-19]。miR-199a-3p作為miRNA的成員之一,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中表達下調,通過有關信號通路參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡[20]。另外,Mishima等[21]研究發(fā)現,RA患者滑膜組織中miR-199a-3p表達水平降低,其可能通過影響前列腺素D2的產生來調節(jié)體內炎癥反應,從而影響RA發(fā)展過程。本研究中RA患者血清miR-199a-3p表達水平降低,與Mishima等[21]的研究結果相似。此外,RA疾病活動度越高,RA患者血清miR-199a-3p表達水平越低,且miR-199a-3p表達水平與RA患者DAS28-CRP、血清類風濕因子水平、血沉均呈負相關,提示miR-199a-3p表達下調可能與RA疾病進程有關,測定血清miR-199a-3p水平有助于臨床判定RA患者的病情。分析其原因可能是miR-199a-3p通過影響炎癥因子產生,介導炎癥反應,從而在RA病變過程中發(fā)揮調節(jié)作用。此外,本文分析了RA患者血清lncRNA TUG1表達水平與血清miR-199a-3p表達水平的相關性,結果顯示,血清lncRNA TUG1表達水平與血清miR-199a-3p表達水平呈負相關,提示lncRNA TUG1可能與miR-199a-3p靶向結合進而共同影響RA病理過程。

綜上所述,RA患者血清lncRNA TUG1表達水平上調,血清miR-199a-3p表達水平下調,二者均與RA疾病活動度顯著相關。測定血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p水平有助于評估RA疾病嚴重程度,可為臨床評估RA患者病情提供新方向。但后期仍需擴大樣本深入研究。