陳壁娜

黃芪為多年生豆科類草本生長的植物，味甘且性溫，最早出現(xiàn)于醫(yī)學典籍《神農本草經》，因其具有養(yǎng)血滋津、斂瘡新生、疏通散痹、固表益氣等效用，可在調節(jié)免疫、抗氧化、保肝、抗炎等中發(fā)揮多重藥理學作用[1]。在我國，黃芪用途廣泛，不僅能夠參與心血管、呼吸、內分泌等疾病的治療且效果良好，同時在保護心肌細胞、調節(jié)血壓等方面也取得了一定的進展[2]。黃芪不僅包含黃酮、皂苷、多糖、微量元素以及其他有機物等化學成分，同時也包括甲苷類、多糖類及酮類化合物，這些均是黃芪中較為重要的活性成分。現(xiàn)階段，隨著藥理學研究的不斷深入以及提取檢測方式的不斷完善，臨床中常將有關黃芪的藥理活性以及化學成分等作為關鍵研究對象，而研究中出現(xiàn)的差異性表現(xiàn)則是對應成分提取方法不同的體現(xiàn)。本研究對黃芪不同提取方法對化學成分的影響進行探究，旨在為臨床藥物提取方法提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑本研究黃芪源于來北京同仁堂大藥房。取晾曬干燥的黃芪根粉碎，過篩30 目，篩下產物經封閉干燥包裝后保存?zhèn)溆?。將黃芪根切成厚度為2mm 的薄片用于水磨法進行提取。纖維素酶、甲醇、正丁醇、氨水、苯酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2，4，6-三吡啶基均三嗪、維生素C、福林酚試劑。

1.2 儀器與設備超聲波多頻清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SB-500DTY）；分離式磨漿機（滄州利達民用機械廠，型號：DM-ZF-105）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司，型號：HH-2A）；紫外可見分光光度計（日本島津公司，型號：UV-1700）；高效液相色譜儀（美國Waters 公司，型號：LC-2010AHT）。

1.2 方法

1.2.1 獨立提取 ①水磨提?。⊿）：取黃芪片10g，加入60ml 蒸餾水，在40℃下將黃芪片浸泡約7h，研磨過濾后將濾渣進行重復提取。②超聲輔助提?。–）：依據文獻方法[3]取黃芪粉3g，添加60ml 蒸餾水進行超聲提取1h，完成后將提取液進行過濾，再將濾渣重復提取1 次，將兩次濾液進行合并待用。③酶解提?。∕）：依據文獻[4]取黃芪粉5g，加入30ml pH 值為4.5 的磷酸緩沖液，加入纖維素酶0.05g，充分搖勻后60℃下水浴3h，過濾后將濾渣重復提取。④亞臨界提?。╕）：稱取黃芪粉8g，在高溫高壓環(huán)境下加蒸餾水300ml，密封后將氮氣接入5min，高溫條件下提取30min，將提取液過濾后再將濾渣進行重復提取，最后將兩次濾液進行合并。

1.2.2 聯(lián)合提取 ①超聲輔助聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y）：首先在超聲條件下進行提取，完成后再在亞臨界提取條件下進行成分提取。②酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y）：首先在酶解條件下進行提取，提取完成后再利用亞臨界條件進行成分提取。③水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y）：首先在水磨條件下進行提取，提取完成后再在亞臨界條件下進行成分提取。

1.3 黃芪提取物檢測

1.3.1 黃芪總皂苷 用等量正丁醇將提取液進行提取，共3 次，在與正丁醇液聯(lián)合后，使用飽和氨溶液清洗3 次，正丁醇飽和水溶液清洗3 次，去掉正丁醇后將剩余殘渣用甲醇定容，取得樣品黃芪總皂苷。依據文獻[5]使用香草醛-高氯酸比色法檢測黃芪總皂苷總提取率，總皂苷提取率=提取液中總皂苷含量/原料質量×100%。

1.3.2 黃芪總黃酮 將20ml 提取液轉移到100ml 的分液漏斗中，添加20ml 水飽和正丁醇，搖勻后提取，共3 次，正丁醇液結合后將溶劑蒸發(fā)，取殘渣用甲醇溶解后定容，依據文獻[5]采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法測定黃芪總黃酮提取率?？傸S酮提取率=提取液中總黃酮含量/原料質量×100%。

1.3.3 黃芪多糖 取5ml 提取液放置在10ml 離心管內，放入3ml 無水乙醇，震蕩后冷藏12h，離心，取沉淀無水乙醇5ml，清洗后離心，沉淀加蒸餾水溶解，放在容量瓶內定容，取得樣品，依據文獻[6]采用苯酚-硫酸比色法測定黃芪多糖提取率，多糖提取率=提取液中多糖含量/原料質量×100%。

1.4 黃芪提取物抗氧化能力檢測取DPPH 自由基清除力定容后的提取物2ml 及0.2mmol/L DPPH 溶液2ml，混合后搖勻，20min 后500nm 波長檢測吸光度值Ai，0.2mmol/L DPPH 溶液2ml 和2ml 90% 乙醇溶液混勻后的吸光度Aj，分別檢測2ml 提取物和90%乙醇混合后的吸光度Ac，共計3 次，其中清除率SR（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%；ABTS+自由基清除力和鐵離子還原能力檢測依據文獻[7]，結果以每克干物質中Vc 的含量表示。

1.5 統(tǒng)計學方法采用GraphPadPrism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各提取方法的黃芪總皂苷提取率比較在各提取方法中，黃芪總皂苷的提取率由高到低依次為C＋Y、M ＋Y、C、Y、S ＋Y、S、M，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各提取方法的黃芪總皂苷提取率比較（±s，%）

表1 各提取方法的黃芪總皂苷提取率比較（±s，%）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋

提取方法提取率水磨提?。⊿）0.96±0.15超聲輔助提取（C） 2.59±0.98*酶解提?。∕） 0.52±0.07*#亞臨界提取（Y） 1.82±0.25*#&超聲聯(lián)合亞臨界提取（C ＋Y） 4.86±2.38*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 3.65±1.96*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y） 1.40±0.50*#&%@￥F 5.119 P 0.001

2.2 各提取方法的黃芪總黃酮提取率比較在各提取方法中，黃芪總黃酮的提取率由高到低依次為S、C ＋Y、M ＋Y、M、Y、C、S ＋Y，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各提取方法的黃芪總黃酮提取率比較（±s，%）

表2 各提取方法的黃芪總黃酮提取率比較（±s，%）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋Y 比較￥P<0.05

提取方法提取率水磨提?。⊿）4.88±2.26超聲輔助提?。–） 0.43±0.19*酶解提取（M） 1.75±0.82*#亞臨界提?。╕） 0.83±0.36*#&超聲聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y） 3.63±1.62*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提取（M ＋Y） 2.58±1.20*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y） 0.28±0.08*#&%@￥F 6.205 P 0.001

2.3 各提取方法的黃芪多糖提取率比較在各提取方法中，黃芪多糖的提取率由高到低依次為M、S＋Y、C ＋Y、S、M ＋Y、Y、C，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 各提取方法的黃芪多糖提取率比較（±s，%）

表3 各提取方法的黃芪多糖提取率比較（±s，%）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋Y 比較￥P<0.05

提取方法提取率水磨提?。⊿）4.59±0.60超聲輔助提?。–） 1.23±0.09*酶解提?。∕） 6.95±1.33*#亞臨界提?。╕） 2.69±0.20*#&超聲聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y） 4.80±0.72*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 3.73±0.39*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y） 5.78±1.20*#&%@￥F 17.510 P 0.001

2.4 各提取方法的黃芪抗氧化性比較各提取方法的黃芪水提物對DPPH、ABTS+自由基清除力以及鐵離子還原能力由高到低依次為M ＋Y、Y、C ＋Y、S ＋Y、S、C、M，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。Y 比較￥P<0.05

表4 各提取方法的黃芪抗氧化性比較（±s，mgVc/g）

表4 各提取方法的黃芪抗氧化性比較（±s，mgVc/g）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋Y 比較￥P<0.05

提取方法DPPHABTS+鐵離子還原能力水磨提?。⊿）20.57±1.887.45±1.2021.80±5.35超聲輔助提取（C） 9.62±1.12* 4.67±0.62* 10.98±1.40*酶解提?。∕） 5.05±0.38*# 2.12±0.10*# 4.20±0.17*#亞臨界提?。╕） 59.32±4.70*#& 30.66±4.65*#& 185.89±23.89*#&超聲聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y） 45.45±3.69*#&% 21.75±3.70*#&% 153.69±16.67*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 71.69±5.69*#&%@ 41.89±5.59*#&%@ 224.89±32.25*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提取（S ＋Y） 31.22±2.79*#&%@￥ 12.65±2.69*#&%@￥ 74.05±9.72*#&%@￥F 15.8206.5096.187 P 0.0010.0010.001

3 討論

多項研究表明，黃芪含有黃酮類、苷類、多糖類等多種化學成分，同時其化學組成復雜且藥理學作用廣泛，在臨床中有著極為廣闊的應用前景[8]。本研究各類提取方法在黃芪總皂苷取得情況的結果顯示，在單一提取方式中，使用超聲輔助法提取的含量較高，亞臨界法次之，而酶解法的提取率最低。分析原因，可能是由于黃芪總皂苷的穩(wěn)定性較好，當進行超聲輔助提取時，由于超聲波產生的熱效應及空化反應可在一定程度上對黃芪的細胞壁結構造成破壞，進而增加了化合物的快速溶出率。而當采用亞臨界法提取時，由于溫度較高且壓力較大，在這一狀態(tài)下使得提取的水分子極性強烈縮減，導致熱動力學提高，最終增加了有效成分的提取率。而在聯(lián)合提取中，亞臨界和超聲聯(lián)合法的提取率最高，亞臨界和水磨聯(lián)合法的提取率最低，分析原因可能是由于超聲波在工作中能夠產生一定的纖維素酶并同時伴隨發(fā)生空化反應，而這種反應可與提取物細胞壁所產生的降解反應產生作用，因此，在多種因素的共同作用下使得黃芪的細胞結構徹底被破壞，使皂苷大量溶解并濾出。

本研究在黃芪總黃酮的提取中發(fā)現(xiàn)，水磨法的提取率最高，大約是其他提取方法的2 倍以上，分析原因可能為，在進行水磨法提取時，由于提取中是僅僅對于原材料本身產生作用，且在促進黃酮類化合物濾出的同時并不會造成其他因子的破壞，因而極大地提高了提取率及提取純度。而在單一提取方式里，纖維素酶能夠在一定程度上對植物的細胞壁結構進行破壞，進而促進了植物活性成分的大量濾出，酶解提取法的取得率次之。而與單一的提取方式相比，聯(lián)合提取法在總黃酮提取率上的優(yōu)勢并不顯著，原因是由于黃酮類物質穩(wěn)定性較差，且在高溫狀態(tài)下容易產生分解反應，因此，在進行聯(lián)合提取時對黃酮的提取率相對較低。

本研究在黃芪多糖提取中發(fā)現(xiàn)，酶解提取法對黃芪多糖的提取率中最高，而超聲輔助提取法的提取率最低，可能是在超聲環(huán)境下，長期的超聲干預導致多糖因子的結構發(fā)生進行性破壞，從而促進了多糖的提取率[9]。且有研究表示，經纖維素酶干預后，黃芪多糖可在質量分數(shù)不發(fā)生改變的情況下增加提取率[10]。這一結果與本研究相類似。超聲與亞臨界共同提取法所取得的多糖更多，分析原因可能為當進行聯(lián)合提取時，能縮短提取時間以及增加提取效率，也從一定程度上避免了黃芪多糖由于環(huán)境因素而發(fā)生降解反應。另有學者在利用超聲聯(lián)合提取法對植物多糖進行提取的研究中發(fā)現(xiàn)，由于超聲的共同作用，能夠更明顯地改變單糖的形態(tài)結構及組成，并顯著增加多糖的提取率[11]。

據報道，多種病理及生理學表征均與自由基的產生有一定相關性[12]。由于黃芪具有一定的抗氧化效用，分析其抗氧化活性可為黃芪在臨床治療及藥物干預中的具體作用機制提供更加準確的方向。經研究，DPPH 自由基性質較為穩(wěn)定，可以被抗氧化劑和一些能夠提供質子等相關因子的清除劑消除，并使其吸光度下降[13]。本研究在DPPH、ABTS+自由基清除率和鐵離子還原能力對黃芪水提物抗氧化能性的檢測中發(fā)現(xiàn)，不同提取方法得到的黃芪提取液對DPPH、ABTS+自由基清除力和鐵離子還原能力均能夠表現(xiàn)出相同的趨勢，即亞臨界與其他方法聯(lián)合提取或者單獨采用亞臨界法進行提取時，體外的抗氧化能力均較強，其中以酶解聯(lián)合亞臨界提取法的抗氧化能力最強?？梢?，不同的提取方法對黃芪的抗氧化性可能產生不同程度的影響。分析原因可能為，黃芪中含有較為豐富的氨基酸和還原性糖類，而氧化反應發(fā)生時會導致物質本身的狀態(tài)產生改變，不會產生大量新生的活性物質，這些物質在一定程度上為氧化反應提供了必需的羰基和氨基化合物，進一步參與氧化反應[14，15]。所以這些物質極有可能比皂苷、多糖、黃酮具有更高的抗氧化活性。

綜上所述，超聲聯(lián)合亞臨界提取法對黃芪總皂苷的提取率更高，水磨法對黃芪總黃酮的提取率更高，酶解提取法對黃芪多糖的提取率更高。而不同提取法對黃芪的抗氧化能力影響也不同，其中酶解聯(lián)合亞臨界提取法在DPPH、ABTS+自由基清除及鐵離子還原能力方面均高于其他提取方法。