韋婷艷 何柳芳 韋桂歡 劉付俊業(yè)

新生兒窒息是指新生兒在出生時無法啟動和維持自主呼吸，出生窒息是一種常見的新生兒健康問題，是新生兒發(fā)病和死亡的重要原因[1]。目前關(guān)于新生兒窒息的具體病因還未確定，可能與能量代謝衰竭、氧自由基和再灌注損傷、興奮性氨基酸的毒性作用等密切相關(guān)，但也可能與機(jī)體內(nèi)的腦組織炎癥反應(yīng)有關(guān)[2]。近年來隨著科學(xué)的進(jìn)步，越來越多的研究證實，microRNA（miRNA）參與新生兒窒息的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)的失調(diào)與新生兒窒息造成的損傷相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-214 在神經(jīng)元損傷中低表達(dá)，高表達(dá)的miR-214 可緩解海馬神經(jīng)元的損傷[4]，此外miR-214 在心血管疾病中也扮演重要角色[5]。然而miR-214 是否也參與了新生兒窒息造成的神經(jīng)功能障礙還未可知。本研究旨在探究miR-214 與窒息新生兒神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后的相關(guān)性，以期為新生兒窒息臨床治療提供參考思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象前瞻性連續(xù)收集我院2021年3月～2022年3月出生窒息的新生兒30 例（觀察組）和同期出生的正常新生兒30 例（對照組）作為研究對象，觀察組參照2016年中華醫(yī)學(xué)會圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會新生兒復(fù)蘇學(xué)組制定的新生兒窒息診斷專家共識[6]作出診斷。本研究經(jīng)深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并獲得受試者監(jiān)護(hù)人自愿簽署的知情同意書。兩組新生兒一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①胎齡37～41+6周的足月兒；②出生體重>2 500g；③出生時有窒息診斷；④出生24h 內(nèi)入住新生兒科。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①胎齡37～41+6周的足月兒；②出生體重>2 500g；③出生時無窒息診斷；④無宮內(nèi)窘迫史。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有嚴(yán)重感染、低血糖腦損傷、TORCH 感染、膽紅素腦病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、先天畸形及遺傳代謝疾病等的新生兒。

1.3 研究方法miR-214表達(dá)水平檢測方法：所有受試患兒均進(jìn)行臍帶采血（2ml）及出生后3 天、7 天進(jìn)行外周動脈采血2ml，所有血標(biāo)本離心（12 000rpm，10min，離心半徑10cm）后取血清，提取RNA 后進(jìn)行定量，然后使用Taq-ManmiRNA Reverse Transcription 試劑盒將定量的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA，以U6 為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增（95℃預(yù)變性10min進(jìn)行1 個循環(huán)，95℃變性15s，60℃復(fù)性1min，45 個循環(huán)），實驗重復(fù)3 次，計算△Ct 值，采用2-△△Ct法計算miR-214 的相對表達(dá)水平。miR-214 引物序列為F：5'-CAATACTGACAGCAGGCACA-3'，R：5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTAC-3'；U6 引物序列為F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTC ACGAATTTGCGT-3'。項）：頭豎立反應(yīng)（頸屈伸?。?、手握持、牽拉反應(yīng)、直立支持反應(yīng)，共8 分；③被動肌張力（4 項）：圍巾征、上肢彈回、下肢彈回、腘窩角，共8 分；④原始反射（3 項）：自動踏步、吸吮反射、擁抱反射，共6 分；⑤一般評估（3 項）：覺醒度、哭、活動度，共6 分；5 部分共20 項，總分為40 分；檢查工具包括手電筒、格格球和小紅球各1 個。評定標(biāo)準(zhǔn)：38～40 分為正常，36～37 分為可疑，35 分及以下為異常。

分析新生兒出生后3 天和7 天的血清miR-214表達(dá)水平與NBNA 評分的相關(guān)性；分析血清miR-214表達(dá)水平與NBNA 評分對窒息新生兒的預(yù)后影響；miR-214 水平對新生兒窒息的預(yù)測價值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較使用t檢驗；計數(shù)資料采用例表示，使用卡方（χ2）檢驗；重復(fù)測量的方差分析比較兩組miR-214 水平；采用Pearson 法分析血清miR-214 水平與NBNA 評分相關(guān)性；影響因素的確定使用二元Logistic 回歸分析；ROC 曲線評估m(xù)iR-214 水平對新生兒窒息的診斷價值，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

新生兒行為神經(jīng)測定（Neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）評分：所有受試患兒均由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行評估，室溫在25℃～28℃，保持室內(nèi)環(huán)境安靜，在哺乳后1h 進(jìn)行測定，并在10min 內(nèi)完成。

2 結(jié)果

1.4 觀察指標(biāo)記錄兩組患兒臍帶血、出生后第3天、第7 天血漿miRNA-214表達(dá)水平和出生后第3 天、第7 天NBNA 評分。NBNA 評分共包括5 部分：①新生兒行為能力（6 項）：對光的習(xí)慣形成、對咯咯聲的反應(yīng)、對說話人臉反應(yīng)、對咯咯聲的習(xí)慣形成、對紅球的反應(yīng)、可安慰性（指正在哭鬧的新生兒對外界安慰的反應(yīng)），共12 分；②主動肌張力（4

2.1 兩組新生兒血miR-214 水平、NBNA 評分的比較觀察組新生兒臍帶血、出生后第3 天、第7 天血漿miRNA-214表達(dá)水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），同時隨著出生時間的推移，血漿miR-214表達(dá)水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；觀察組新生兒出生后第3 天、第7 天NBNA 評分顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），同時觀察組新生兒第7 天的NBNA 評分高于第3 天評分，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組新生兒血miR-214表達(dá)及NBNA 評分比較（±s）

表2 兩組新生兒血miR-214表達(dá)及NBNA 評分比較（±s）

注：與同組臍帶血比較，*P<0.05；與同組第3 天比較，#P<0.05

分組例數(shù)miR-214 水平NBNA 評分（分）臍帶血第3 天第7 天第3 天第7 天對照組300.97±0.280.94±0.271.01±0.1238.31±1.27 38.25±0.89觀察組300.77±0.100.51±0.09* 0.38±0.10*#30.60±1.09 34.94±1.30#t 3.6848.27522.09125.23211.507 P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 血miR-214 水平與NBNA 評分的相關(guān)性分析觀察組新生兒出生后3 天和7 天的血miR-214表達(dá)水平與NBNA 評分均呈顯著正相關(guān)（P<0.05），見圖1。

圖1 血miR-214表達(dá)水平與NBNA 評分的相關(guān)性分析

2.3 窒息新生兒神經(jīng)預(yù)后影響因素分析以是否為窒息新生兒為二分類因變量（賦值0：沒有發(fā)生窒息，1:發(fā)生窒息），并以miR-214 水平和NBNA 評分作為自變量，進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，miR-214 水平和NBNA 評分均為新生兒窒息的相關(guān)影響因素（P<0.05），見表3。

表3 Logistic 回歸分析窒息新生兒神經(jīng)預(yù)后影響因素

2.4 miR-214 水平對新生兒窒息的預(yù)測價值ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-214 水平對新生兒窒息的預(yù)測AUC 為0.839；最佳截值為0.633，95%CI為0.732～0.946，其敏感度和特異性分別為90%和73.3%，見圖2。

圖2 miR-214 水平對新生兒窒息預(yù)測價值的ROC 曲線

3 討論

miRNA 是近年來的研究熱點，是一種內(nèi)源性小非編碼RNA，一般由18～24 個核苷酸組成[7]，miRNA 的表達(dá)譜已在新生兒窒息疾病中被發(fā)現(xiàn)，提示其可能對新生兒窒息發(fā)展起重要作用[8]。在人類基因組中，約有700 個miRNAs，主要參與調(diào)控細(xì)胞分化、代謝、凋亡、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移和遷移、神經(jīng)元發(fā)育等重要的生物學(xué)過程[9，10]。大量實驗已證實，miRNA 參與神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)及缺血后神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)，如張赫娛[11]在動物實驗中證實，miR-21過表達(dá)可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦出血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 的差異表達(dá)與新生兒窒息相關(guān)，可作為早期診斷窒息新生兒神經(jīng)預(yù)后的標(biāo)志物[12]，但關(guān)于miRNA 預(yù)測窒息新生兒神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)報道仍然較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，窒息組新生兒臍帶及出生后3、7 天的血miR-214表達(dá)水平分別為（0.51±0.09）和（0.38±0.10），與對照組的（0.94±0.27）和（1.01±0.12）比較均顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移miR-214表達(dá)水平逐漸顯著降低，這提示低表達(dá)的miR-214 參與了新生兒窒息的發(fā)生。窒息可造成新生兒神經(jīng)系統(tǒng)障礙，威脅患兒生命健康，王姬[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-214表達(dá)的下調(diào)參與了幼鼠神經(jīng)元的凋亡，同時也在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-214 的高表達(dá)可與PTEN、Bim 和Bax 蛋白結(jié)合進(jìn)而抑制急性神經(jīng)細(xì)胞凋亡[14]。這些結(jié)果提示，miR-214 的差異表達(dá)與窒息新生兒神經(jīng)系統(tǒng)障礙相關(guān)。

NBNA 是一種評定新生兒行為的良好指標(biāo)，可以較全面地反映大腦功能，對神經(jīng)系統(tǒng)的代償性恢復(fù)具有重要意義，對神經(jīng)預(yù)后及腦神經(jīng)異常具有重要的臨床意義[15]。研究已證實，與正常新生兒比較，窒息新生兒的NBNA 評分降低[16]，本研究中，對照組新生兒出生后第3、7 天NBNA 評分為（38.31±1.27）分和（38.25±0.89）分，窒息組新生兒出生后第3、7 天的NBNA 評分為（30.60±1.09）分和（34.94±1.30）分。與對照組相比，窒息組新生兒NBNA 評分明顯下降，提示，窒息組新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)功能下降，陳建濤[16]研究結(jié)果中正?；純旱腘BNA 評分為（37.16±2.58）分，腦損傷輕度組NBNA 評分為（32.85±2.47）分以及重度組為（28.49±2.46）分，與本研究結(jié)果相一致。此外相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，窒息組新生兒第3 天和第7 天血清miR-214表達(dá)水平與NBNA 評分呈顯著正相關(guān)，表明miR-214 的表達(dá)水平越低，NBNA 評分就越低，由此推測miR-214 水平可能是反映窒息新生兒神經(jīng)預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)。進(jìn)一步以是否為窒息新生兒為二分類因變量做Logistic 回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-214 水平和NBNA 評分是新生兒窒息的相關(guān)影響因素，同時ROC 曲線分析表明，miR-214 水平對窒息新生兒神經(jīng)預(yù)后的預(yù)測價值較高，具有較高的敏感度和特異性。

綜上，血清miR-214表達(dá)水平可較好地反映窒息新生兒神經(jīng)預(yù)后情況，然而本研究仍存在不足之處，如樣本量較少等，以及miR-214表達(dá)水平對鑒別新生兒窒息嚴(yán)重程度是否同樣具有診斷性還不清楚，仍需進(jìn)一步的實驗進(jìn)行驗證。