韓永良 汪亮亮 王潔 趙銳

漿膜腔積液病因復(fù)雜，良惡性疾病均可引起。其中惡性腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移引起漿膜腔積液約占15%～20%[1]。目前細(xì)胞學(xué)是診斷漿膜腔積液良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)，但敏感度僅為60%[2]，而且易受病理醫(yī)師主觀因素影響。常用腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白（AFP）、糖類(lèi)抗原（CA）125、CA199 及角蛋白（CK）等在惡性轉(zhuǎn)移癌及良性間皮細(xì)胞增生之間的鑒別作用有限[3]。本研究利用免疫組化方法檢測(cè)漿膜腔積液細(xì)胞蠟塊中Survivin 、IMP3 及Claudin1 的表達(dá)情況，綜合分析其在良惡性漿膜腔積液中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集我院2017年2月～2021年11月行細(xì)胞蠟塊及免疫組化檢查且臨床資料完整的漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)標(biāo)本共計(jì)95 例，其中惡性漿膜腔積液84 例，良性11 例。所有患者均未進(jìn)行放化療。

1.2 試劑所用試劑Survivin、Claudin1 及IMP3（克隆號(hào)EP286）以及二抗均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法將所有漿膜腔積液標(biāo)本放置4℃冰箱內(nèi)靜止30min 以上，倒掉上清液留沉淀部分約100ml，分別裝入2 個(gè)50ml 離心管中，2 000r/min 離心5min，除去上清液，留取細(xì)胞沉渣。若細(xì)胞成分較少，則加入95%乙醇震蕩混勻，再次2 000r/min 離心3min，靜置40min，除去上清液，然后加入10%中性福爾馬林緩沖溶液固定2h，取出凝固成塊細(xì)胞沉淀物，紗布包裹放入包埋盒中常規(guī)脫水、包埋、切片、染色[4]。根據(jù)腫瘤來(lái)源分為肺腺癌組（n=41）、消化系統(tǒng)腺癌組（n=25）、卵巢惡性腫瘤組（n=9）以及其他惡性腫瘤組（n=9）。良性標(biāo)本為對(duì)照組，免疫組化采用EnVision 兩步法，在BOND-MAX 自動(dòng)免疫組化染色儀上進(jìn)行，具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)Survivin、IMP3 及Claudin1 蛋白的表達(dá)以腫瘤細(xì)胞胞漿和（或）胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。計(jì)數(shù) 500 個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1%計(jì)為陰性、1%～25%為“+”、>25%～50%為“++”、>50%為“+++”，結(jié)果由兩名高級(jí)職稱的病理醫(yī)師在雙盲情況下觀察確定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間Survivin、IMP3 及Claudin1 蛋白的表達(dá)采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征84 例惡性漿膜腔積液患者年齡29～86 歲，男41 例，女43 例。胸腔積液53 例，腹腔積液31 例。其中來(lái)源于肺腺癌41 例、消化系統(tǒng)腺癌25 例、卵巢惡性腫瘤9 例、其他惡性腫瘤9 例。其中胸腔積液內(nèi)，37 例（69.81%）來(lái)源于肺腺癌，5例來(lái)源于消化系統(tǒng)腺癌，9 例來(lái)源于其他惡性腫瘤，2 例卵巢惡性腫瘤。腹腔積液內(nèi)20 例（65.51%）來(lái)源于消化系統(tǒng)腺癌，7 例來(lái)源于卵巢惡性腫瘤，4 例來(lái)源于肺腺癌。

2.2 漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)形態(tài)肺腺癌腫瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核大、深染，可見(jiàn)一個(gè)或幾個(gè)核仁，部分細(xì)胞核偏位，胞漿豐富，部分胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡。呈腺樣、乳頭狀或單個(gè)散在排列（見(jiàn)圖1）。消化系統(tǒng)腺癌腫瘤細(xì)胞體積較大，細(xì)胞界限不清，核偏位或位于胞體邊緣，核膜不規(guī)則，染色質(zhì)深染，可見(jiàn)大核仁，胞漿多空泡狀，呈團(tuán)或單個(gè)排列，部分病例可見(jiàn)黏液（見(jiàn)圖2）。卵巢惡性腫瘤與肺腺癌及消化系統(tǒng)腺癌細(xì)胞學(xué)形態(tài)相似，細(xì)胞異型性明顯，核漿比增大，細(xì)胞核空泡狀，核仁可見(jiàn)，呈乳頭樣、桑葚樣排列（見(jiàn)圖3）；肺小細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞體積較小，大小較一致，胞漿稀少，染色質(zhì)細(xì)膩，椒鹽狀，呈列兵狀或鑲嵌狀排列（見(jiàn)圖4）。

圖1 肺腺癌細(xì)胞形態(tài)

圖2 消化系統(tǒng)腺癌腫瘤細(xì)胞形態(tài)

圖3 卵巢惡性腫瘤細(xì)胞形態(tài)

圖4 肺小細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞形態(tài)

2.3 各組 IMP3 蛋白的表達(dá)情況IMP3 定位于細(xì)胞漿，呈棕色顆粒狀（見(jiàn)圖5）。肺腺癌組IMP3 陽(yáng)性率為46.34%（19/41），消化系統(tǒng)腺癌組陽(yáng)性率為44.00%（11/25），卵巢惡性腫瘤組陽(yáng)性率為33.33%（3/9），其他惡性腫瘤組陽(yáng)性率為22.22%（2/9），對(duì)照組陽(yáng)性率為9.10%（1/11）。肺腺癌組及消化系統(tǒng)腺癌組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.085、4.189，P=0.035、0.043），而卵巢惡性腫瘤組及其他惡性腫瘤組IMP3 的表達(dá)情況與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.181、0.669，P=0.285、0.421）。

圖5 腫瘤細(xì)胞IMP3 彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（EnVision 兩步法）

2.4 各組Claudin1 蛋白的表達(dá)情況Claudin1 主要定位于細(xì)胞漿，呈棕色顆粒狀（見(jiàn)圖6）。肺腺癌組Claudin1 陽(yáng)性率為36.59%（15/41）、消化系統(tǒng)腺癌組陽(yáng)性率為56.00%（14/25）、卵巢惡性腫瘤組陽(yáng)性率為55.56%（5/9）、其他惡性腫瘤組陽(yáng)性率為22.22%（2/9），對(duì)照組陽(yáng)性率為18.18%。消化系統(tǒng)腺癌組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.425，P=0.039），肺腺癌組、卵巢惡性腫瘤組及其他腫瘤組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.335、3.039、0.052，P=0.304、0.160、0.625）。

圖6 腫瘤細(xì)胞Claudin1 彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（EnVision 兩步法）

2.5 各組Survivin 蛋白的表達(dá)情況Survivin 定位于細(xì)胞核（見(jiàn)圖7）。肺腺癌組Survivin 陽(yáng)性率為24.39%例（10/41），消化系統(tǒng)腺癌組陽(yáng)性率為12.00%（3/25），卵巢惡性腫瘤組、其他惡性腫瘤組及對(duì)照組陽(yáng)性率均為22.22%（2/9），各組與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.217、0.065、0.669、0.669，P=0.204、0.430、0.347、0.347）。

圖7 腫瘤細(xì)胞Survivin 陽(yáng)性表達(dá)（EnVision 兩步法）

3 討論

漿膜腔積液在臨床上常見(jiàn)，有時(shí)甚至是患者的唯一癥狀。并且標(biāo)本容易獲取，對(duì)患者創(chuàng)傷小，尤其適合年老體弱并且無(wú)法獲得活檢組織的患者。細(xì)胞學(xué)不僅可以判斷其良惡性，還可利用免疫組化及分子尋找來(lái)源，對(duì)治療及預(yù)后有重要的臨床意義[5～7]。隨著免疫組化在細(xì)胞塊中的應(yīng)用，部分腫瘤細(xì)胞的來(lái)源及良惡性可確定，但在惡性腫瘤及間皮細(xì)胞間的鑒別作用有限。有研究顯示，胸腔積液中男性81.8%來(lái)源于肺腺癌，女性則60%來(lái)源于肺腺癌，25%來(lái)源于乳腺癌；在腹腔積液中男性最常見(jiàn)來(lái)源為胃腸道腫瘤（60%），女性則63.3%來(lái)源于卵巢惡性腫瘤[8]。本研究顯示，胸腔積液中，69.81%來(lái)源于肺腺癌，少部分來(lái)源于其他惡性腫瘤。腹腔積液中65.51%來(lái)源于消化系統(tǒng)腺癌，與上述報(bào)道相符。

Survivin 作為抗凋亡蛋白（IAP）家族中最小的成員，是由BIRC5 基因（桿狀病毒）編碼的蛋白，定位于17q25 號(hào)染色體上，N'端與C'端通過(guò)BIR 區(qū)域關(guān)聯(lián)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這個(gè)區(qū)域在染色體的形成和相互作用中起重要作用，特別是在細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程中作用重大[9]。并且對(duì)于癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有調(diào)控作用，使上皮惡性腫瘤細(xì)胞突破基底膜組織的能力增加[10]。有研究顯示在卵巢癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高的患者病灶中Survivin 蛋白的陽(yáng)性率約為65%，明顯高于轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較低的卵巢癌患者，并且Survivin 的表達(dá)情況能夠影響到臨床分期及組織分化程度[11]。本研究顯示，卵巢惡性腫瘤組織Survivin陽(yáng)性率與其他惡性腫瘤組陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

IMP3 是一種與多種腫瘤相關(guān)的胎兒蛋白，胰島素樣生長(zhǎng)因子ⅡmRNA 結(jié)合蛋白家族包括：IMP1、IMP2 及IMP3。IMP3 蛋白基因位于人類(lèi)染色體7p11.5，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為6.5×104的RNA 結(jié)合蛋白[12]。與IGF-ⅡmRNA 的5'端非編碼區(qū)相結(jié)合，激活多條細(xì)胞信號(hào)通路，從而促進(jìn)IGF-Ⅱ的翻譯，使其蛋白表達(dá)水平上調(diào)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖。IMP3 正常存在于胚胎早期階段，在發(fā)育中的肌肉和胎盤(pán)及上皮組織可有所表達(dá)，但在正常成人體的組織內(nèi)幾乎不能被檢測(cè)到[13]。大量研究顯示IMP3 可在人類(lèi)多種惡性腫瘤中表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌及胃腸道癌，并且與預(yù)后有關(guān)[14，15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IMP3 可用于腹膜惡性腫瘤及間皮反應(yīng)性增生中，并且與增殖指數(shù)密切相關(guān)，此外與年齡、性別及組織學(xué)類(lèi)型有關(guān)[16]。本研究顯示，卵巢惡性腫瘤組及其他惡性腫瘤組與對(duì)照組的IMP3 陽(yáng)性率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其陽(yáng)性率（33.33%、22.22%）還是高于對(duì)照組（9.10%）。因此，IMP3 是鑒別良性及惡性漿膜腔積液的一個(gè)比較可靠的指標(biāo)。

正常組織的細(xì)胞之間主要依靠緊密連接復(fù)合體來(lái)維持細(xì)胞之間的黏附性及細(xì)胞的極性。而惡性腫瘤則失去正常細(xì)胞之間的黏附性及極性，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)不受控制，致使腫瘤細(xì)胞具有侵襲性，且更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[17]。細(xì)胞之間的緊密連接是由一些緊密連接帶組成，構(gòu)成緊密連接的蛋白主要有Claudin 1、occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3、cingulin 及MUPP1 等[18]，其中最重要的為Claudin 1、occludin。Claudin 1 蛋白是由相對(duì)分子量25 000～27 000 的蛋白組成，主要由CLDN 基因家族編碼，在哺乳動(dòng)物中由 27 個(gè)成員組成[19]。Claudin 1蛋白是通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相互作用來(lái)維持細(xì)胞與細(xì)胞之間的緊密連接作用。Claudin 1 蛋白的異常表達(dá)說(shuō)明細(xì)胞之間的緊密連接功能失常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，目前，研究顯示Claudin 1蛋白在乳腺癌、肝癌、肺癌、腸癌等都有表達(dá)[20～22]。Huang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin1 在胃癌中可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α 誘導(dǎo)的基因表達(dá)從而影響腫瘤遷移等。本研究顯示，消化系統(tǒng)腺癌組Claudin1 陽(yáng)性率最高，并且與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組陽(yáng)性率也明顯高于對(duì)照組，特別是卵巢惡性腫瘤組，因此Claudin1 在良惡性腫瘤中也可作為一個(gè)潛在的免疫標(biāo)記物。

綜上，IMP3、Claudin1 蛋白對(duì)漿膜腔積液良惡性及腫瘤來(lái)源具有鑒別意義，尤其是IMP3 在診斷消化系統(tǒng)腺癌或肺腺癌來(lái)源時(shí)可作為一個(gè)可靠指標(biāo)，Claudin1 可作為診斷肺腺癌來(lái)源的免疫標(biāo)志物，而Survivin 對(duì)漿膜腔腔積液良惡性及惡性腫瘤來(lái)源無(wú)鑒別意義。