鐘世順 梁瑋 許炎欽 劉進生

結腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，也是第二常見的惡性腫瘤死亡原因[1]。結腸癌的發(fā)生與環(huán)境、飲食、腸道微生物等因素有關[2]。已有研究表明，腸道微生物會多方面影響腸道健康，包括對腸道細胞特征、新陳代謝和免疫的影響[3，4]。腸道微生物是寄居在人體腸道內(nèi)的龐大、復雜的微生物群落[5]。益生菌是一類重要的腸道微生物，可以通過平衡腸道微生物菌群和增強消化系統(tǒng)中的營養(yǎng)吸收，對宿主產(chǎn)生有利影響[6]。

雙歧桿菌屬是常見的益生菌。雙歧桿菌是一種革蘭氏陽性、不運動、細胞呈桿狀、一端有時呈分叉狀的厭氧細菌。其能夠合成氨基酸、硫胺素和核黃素，是腸道菌群的重要組成成員之一，在抑制腸道病原體的定植、保持腸道微生物穩(wěn)態(tài)、保護腸道黏膜屏障的完整性等方面發(fā)揮著重要作用[7]。已有研究表明，雙歧桿菌可以調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群組成，提高短鏈脂肪酸含量，提高腸道屏障相關基因的表達，進而有效緩解小鼠潰瘍性結腸炎[8]。除了緩解腸炎方面的研究外，Bahmani 等[9]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能抑制結腸癌細胞的生長。本研究評估體外條件下雙歧桿菌對人結腸癌DLD-1 細胞系增殖、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)結腸癌細胞系DLD-1 從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American type culture collection，ATCC）獲得，DLD-1 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 細菌培養(yǎng)將雙歧桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，室溫5 000g 離心4min 收獲雙歧桿菌細胞，并將其重新懸浮在培養(yǎng)基，制備成1×108CFU/ml 的雙歧桿菌懸液。

1.3 CCK-8 實驗將DLD-1 細胞按照2 000 個/孔的數(shù)量加到含180μl 完全培養(yǎng)基的96 孔板中。實驗組中每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液（雙歧桿菌終濃度為1×107CFU/ml），對照組中每孔加入20μl 的培養(yǎng)液。每組包含6 個復孔，設置0、24h、48h、72h 4 個時間梯度。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測量時在培養(yǎng)孔中加入10μl CCK8 試劑后置于37℃靜置1h。在460nm 波長處測量每個培養(yǎng)孔的OD 值。

1.4 劃痕實驗將DLD-1 細胞以每孔1×106個接種于6 孔板之中，每組設置3 個復孔，隨后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞與細胞之間契合并鋪滿整個6 孔板時，借助直尺用10μl 的槍頭在6孔板中劃出九宮格，槍頭劃過的地方形成沒有細胞的區(qū)域，用適量的PBS 洗滌培養(yǎng)孔3 遍，吸去PBS，而后每孔加入1.8ml 無血清培養(yǎng)基，實驗組每孔中加入200μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對照組中每孔加入200μl 的培養(yǎng)液。接著進行觀察拍照和記錄，拍攝完畢后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48h 后，吸去無血清培養(yǎng)基，用PBS 洗滌3 次后再次加入2ml 無血清培養(yǎng)基，對劃痕區(qū)域進行拍照，并記錄比對觀察遷移情況。

1.5 Transwell 實驗取一塊新的24 孔板，每孔加入270μl 完全培養(yǎng)液，實驗組每孔加入30μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對照組每孔加入30μl的培養(yǎng)液。將Transwell 小室放入含有完全培養(yǎng)液的24 孔板內(nèi)，將小室的基質膜水化，在Transwell 小室上方加入180μl 無血清培養(yǎng)基，實驗組每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對照組每孔加入20μl 的培養(yǎng)液。將DLD-1 細胞以每孔1×104個接種于小室中，每組設置3 個復孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h 后，取出小室，用移液槍吸取小室中的培養(yǎng)液，使用棉簽小心地擦去小室基質膜上層細胞，在新的24 孔板中加入400μl 結晶紫染液，將擦干凈的小室放入帶有結晶紫染液的孔洞中染色15min。染色后用移液槍吸取染色液，用棉簽擦去基質膜周圍多余的結晶紫染液。顯微鏡觀察小室并拍照記錄。

1.6 統(tǒng)計學分析CCK8 分析采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）方法進行分析，兩組間的差異分析采用Studentt檢驗方法進行分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雙歧桿菌抑制結腸癌細胞DLD-1增殖CCK-8實驗結果表明，相比于對照組，雙歧桿菌組的結腸癌細胞DLD-1 的增殖能力顯著被抑制（P<0.01），見圖1。

圖1 兩組結腸癌細胞DLD-1增殖能力

2.2 雙歧桿菌抑制結腸癌細胞DLD-1 侵襲及遷移劃痕實驗結果表明，相比于對照組，雙歧桿菌可以顯著抑制結腸癌細胞DLD-1 的遷移（P<0.01），Transwell 實驗結果表明，相比于對照組，雙歧桿菌可以顯著抑制結腸癌細胞DLD-1 的侵襲能力（P<0.01）。見圖2、3。

圖2 雙岐桿菌對結腸癌細胞DLD-1 遷移能力的影響

圖3 雙岐桿菌對結腸癌細胞DLD-1 侵襲能力的影響

3 討論

結腸癌是常見的消化道腫瘤。近年來，我國結腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，均位列我國惡性腫瘤前5 位[10]，局部的復發(fā)和轉移是治療失敗的主要原因。結腸癌發(fā)病機制復雜，受多種因素影響。有研究顯示，腸道菌群在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。人類腸道中包含大量的微生物菌群，腸道菌群的變化對宿主的生理有重要影響，比如腸道菌群能影響免疫系統(tǒng)發(fā)育及調(diào)控腸道相關代謝功能等[11]。

雙歧桿菌和乳酸桿菌是人類腸道菌群中重要的益生菌，具有增強免疫力和抗腫瘤功能。大多數(shù)結腸癌患者存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象，其腸道有益菌如雙歧桿菌及乳酸桿菌等較健康人群減少[12]。一項關于益生菌預防腸癌的作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群是影響腸癌進展的最關鍵風險因素，它能夠平衡腸道菌群，減緩腸癌進展。2017年，Hibberd等[13]研究發(fā)現(xiàn)益生菌能干預腸癌患者的腸道微生物菌群，對腸癌患者的治療有潛在的作用。

作為一種重要的益生菌，雙歧桿菌對腸道健康有重要影響，可抑制吸附于腸道上皮細胞的病原體的生長，其主要代謝物乳酸和乙酸均能降低腸道內(nèi)的pH 值，進而抑制許多有害微生物的生長。因此，通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的pH 值是雙歧桿菌發(fā)揮腸道益生菌功能的重要機制之一。此外，還有多項研究表明雙歧桿菌能影響結腸癌的進展。Foo 等[14]通過細胞實驗表明，雙歧桿菌具有抑制抗凋亡蛋白表達，增強促凋亡蛋白表達的作用，進而誘導結腸癌細胞凋亡，抑制結腸癌的進展。大鼠實驗數(shù)據(jù)表明，與未服用雙歧桿菌的大鼠相比，服用雙歧桿菌的大鼠結腸癌的癌前病變可以降低25%左右。另一項結腸癌大鼠模型實驗結果表明，雙歧桿菌等益生菌的混合物可以調(diào)節(jié)平衡大鼠腸道微生物的組成，進而下調(diào)結腸癌的發(fā)生率[15]。Liang 等[16]研究了益生菌對直腸癌患者的影響，結果表明雙歧桿菌三活膠囊對直腸癌患者癥狀有顯著改善作用。

本研究主要通過CCK8、劃痕及Transwell 實驗探究雙歧桿菌對結腸癌細胞DLD-1增殖、侵襲及遷移的影響。結果表明，雙歧桿菌可以顯著抑制結腸癌細胞DLD-1增殖、侵襲及遷移能力。本研究相關內(nèi)容可以為結腸癌的臨床治療和預防提供一定的理論參考。