閆瑩飛, 宮雨曉, 單 丹

(南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院, 南京 210094)

L-半胱氨酸(L-Cys)是天然氨基酸中唯一一種含有巰基的氨基酸, 有助于調(diào)節(jié)氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)和維持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[1], 半胱氨酸含量還是一些疾病的指標(biāo)物, 如艾滋病,尿毒癥,多發(fā)性硬化[2],中風(fēng)[3]等, 因此對體內(nèi)L-Cys含量的檢測具有重要的意義．

半胱氨酸的傳統(tǒng)檢測方法主要有質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜和HPLC-MS/MS[4]等, 但是這些方法具有儀器價格昂貴、樣品數(shù)量大[5]、檢測時間長、操作復(fù)雜[6]等缺點．與傳統(tǒng)方法相比,熒光法具有響應(yīng)時間短、成本低、操作簡單、檢測范圍廣等優(yōu)勢, 因此受到廣泛關(guān)注．例如Yin等[7]通過整合氯化香豆素和苯并噻唑乙腈開發(fā)了一種新型熒光探針, 實現(xiàn)了L-Cys檢測; Qi等[4]利用雙氰基甲基異戊二烯結(jié)構(gòu)和丙烯酸酯合成了具有較大斯托克斯位移和可見發(fā)射波長的CP-NIR熒光探針, 用于L-Cys檢測, 但這些檢測方法仍然存在探針合成困難,檢測限高,檢測成本較大等問題．

金屬有機(jī)框架材料(metal-organic frameworks, MOFs)是一種由金屬離子和有機(jī)配體聚合而成的結(jié)晶納米配位聚合物材料．MOFs材料的優(yōu)勢包括永久孔隙率、高比表面積以及結(jié)構(gòu)靈活性,這些特性使MOFs在催化、氣體吸附[8]、藥物傳遞載體、生物傳感等眾多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用．在MOFs材料中, 拉瓦希爾骨架系列材料(materials of institute Lavoisier frameworks, MIL)優(yōu)異的光學(xué)響應(yīng)使其在熒光方面有廣泛的應(yīng)用, 例如Dong等[9]利用MIL-101和碳量子點復(fù)合進(jìn)行熒光成像;Ai等[10]利用MIL-53和曲酸功能銅納米簇之間的可調(diào)相互作用,可使熒光猝滅．

NH2MIL是由Fe3+和2-氨基對苯二甲酸(NH2BDC)配位而成的結(jié)晶納米配位聚合物, 本文利用Fe3+和半胱氨酸中巰基之間的氧化還原反應(yīng)使NH2MIL解聚, 釋放配體NH2BDC, 通過檢測NH2BDC的熒光發(fā)射強度從而達(dá)到檢測L-Cys的目的, 本文結(jié)果顯示了NH2MIL作為L-Cys傳感器的可行性．

1 實驗部分

1.1 實驗試劑和儀器

六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O),分析純,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 2-氨基對苯二甲酸(NH2BDC),分析純,購自上海麥瑞爾化工科技有限公司;甲醇(CH3OH) 、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鈉(NaOH)均為分析純, 購自國藥集團(tuán)試劑有限公司; 實驗用水均為超純水．測試用氨基酸共12種: 甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司; 賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司、天冬氨酸(Asn)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)購自南京巨優(yōu)科學(xué)器材有限公司．

UV-3600紫外-可見分光光度計(島津公司,日本), TENSOR Model 27型傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(FT-IR, 布魯克科技有限公司,德國), Bruker D8型X射線衍射儀(XRD,布魯克科技有限公司,德國),FEI XL 30E型掃描電子顯微鏡(SEM,FEI公司,美國), Tecnai 20型透射電子顯微鏡(TEM,FEI公司,美國), ESCALAB 250XI型X射線光電子能譜(XPS,賽默飛世爾科技公司,美國)．

1.2 材料的制備與表征

使用水熱法合成NH2MIL, 具體步驟為: 將20 mmol FeCl3·6H2O(5.4 g)溶解到50 ml DMF中,記為溶液A, 然后將20 mmol的NH2BDC(3.6 g)溶解至150 ml DMF中, 記為溶液B,將溶液A和B分別超聲30 min, 然后將A倒入B中并加入8 mL濃度為1 mol·L-1的NaOH, 超聲40 min, 然后將混合液放至100 ℃烘箱中反應(yīng)12 h．反應(yīng)之后在轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1下離心收集樣品, 用DMF和CH3OH分別洗滌三次, 然后在80 ℃下干燥12 h,最后研磨得到NH2MIL樣品,干燥備用．

1.3 熒光發(fā)射光譜測試

NH2MIL檢測L-Cys的基本原理如圖1所示, 在NH2MIL的懸浮液中加入L-Cys, 溶液記為NH2MIL+Cys．溶液中NH2MIL具有強氧化性的Fe3+與L-Cys中具有強還原作用的—SH發(fā)生氧化還原反應(yīng)使Fe—O鍵斷裂,釋放配體NH2BDC至懸浮液中, 通過檢測懸浮液中356 nm處NH2BDC的熒光發(fā)射強度對L-Cys進(jìn)行定量分析．

圖1 NH2MIL檢測半胱氨酸的過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of the process of L-Cys detection by NH2MIL

熒光特異性測試: 配置5 mg·mL-1的NH2MIL懸浮液, 超聲分散30 min, 然后分別配置3 mL濃度為0.1 mol·L-1的NH2MIL和各種氨基酸的混合懸浮液, 孵育1 h后分別進(jìn)行熒光測試, 每個樣品測試3次．

檢測范圍測試: 分別配置含有不同濃度半胱氨酸(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 nmol·L-1)的NH2MIL混合懸浮液各3 mL, 孵育1 h后進(jìn)行熒光測試, 每個樣品測試3次．

抗干擾測試: 在南京理工大學(xué)友誼河3處不同位置取水樣, 用于配置質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的NH2MIL懸浮液, 超聲分散30 min, 然后測試懸浮液中添加L-Cys和不同干擾氨基酸時的熒光強度, 其中L-Cys濃度為100 nmol·L-1, 其余氨基酸濃度為500 nmol·L-1, 每個樣品測試3次并取平均值．

加標(biāo)回收實驗: 取南京理工大學(xué)友誼河的水樣配置質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的NH2MIL懸浮液, 再分別向懸浮液中加入濃度為50, 100和160 nmol·L-1的L-Cys溶液, 對其進(jìn)行熒光強度測試, 根據(jù)線性方程計算回收率．

2 結(jié)果與討論

對NH2MIL和NH2MIL+Cys溶液分別離心、干燥, 然后進(jìn)行SEM和TEM測試, 其形貌變化和元素分布如圖2所示．圖2(a～b)顯示, 加入L-Cys之后, NH2MIL的形貌由非常規(guī)則且有棱角的梭狀結(jié)構(gòu)變?yōu)槌叽巛^小的圓潤的米粒狀結(jié)構(gòu)．這是由于L-Cys中較強還原性的巰基與NH2MIL中的Fe3+反應(yīng), 使NH2MIL表面的配體解聚, 導(dǎo)致形貌變化．對比圖2(c～d)可見, NH2MIL內(nèi)部的結(jié)構(gòu)仍然存在,說明解聚是由外至內(nèi)進(jìn)行的．圖2(f)結(jié)果表明, 反應(yīng)后C,N,O,Fe元素均有不同程度的減少, 但NH2MIL的基本結(jié)構(gòu)骨架仍然保持, 元素分布均勻,說明加入半胱氨酸后材料仍能保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)．

圖2 NH2MIL(a)和NH2MIL+Cys(b)的SEM圖, NH2MIL(c)和NH2MIL+Cys(d)的TEM圖, NH2MIL(e)和NH2MIL+Cys(f)的元素mapping譜圖Fig.2 SEM of NH2MIL(a) and NH2MIL+Cys(b), TEM of NH2MIL (c) and NH2MIL+Cys (d), mapping of NH2MIL(e) and NH2MIL+Cys(f)

圖3是NH2MIL及NH2MIL+Cys材料的XRD測試結(jié)果．圖3表明, NH2MIL與L-Cys反應(yīng)之后, 材料的(100)晶面和(101)晶面的峰強度均有不同程度的減弱, 而(002)晶面峰強度有較大增強．說明L-Cys和NH2MIL之間的氧化還原反應(yīng)使Fe3+和NH2BDC的配位關(guān)系發(fā)生改變, 導(dǎo)致晶面選擇發(fā)生了變化．

圖3 NH2MIL和NH2MIL+Cys的XRD圖譜Fig.3 XRD patterns of NH2MIL and NH2MIL+Cys

圖4 NH2MIL和NH2MIL+Cys中C 1s(a) N 1s(b), O 1s(c), Fe 2p(d)的XPS譜圖Fig.4 XPS spectra of C 1s (a), N 1s (b), O 1s (c), Fe 2p (d) in NH2MIL and NH2MIL+Cys

圖5 NH2MIL, NH2MIL+Cys, NH2BDC的FT-IR譜圖Fig.5 FT-IR spectra of NH2MIL, NH2MIL+Cys, NH2BDC

圖5是NH2MIL, NH2MIL+Cys和NH2BDC的紅外光譜測試結(jié)果．圖5結(jié)果表明, L-Cys中2 550 cm-1處的峰歸因于半胱氨酸中—SH的伸縮振動, 但在反應(yīng)后的材料中并未發(fā)現(xiàn)巰基的特征峰, 這是由于在反應(yīng)的過程中巰基和Fe3+發(fā)生氧化還原反應(yīng)被消耗．519 cm-1處的峰歸因于Fe—O鍵[16], 769 cm-1處的峰歸因于苯環(huán)中C—H的彎曲振動, 1 255 cm-1, 1 337cm-1處的峰歸因于C—N的伸縮振動[13], 1 576 cm-1, 1 384 cm-1處的峰歸因于羰基振動[17], 1 645 cm-1處的峰歸因于N—H的彎曲振動[13], 3 464 cm-1, 3 342 cm-1處的峰歸因于氨基, 這些峰的位置并未發(fā)生變化, 與NH2MIL保持一致．這是由于加入的L-Cys的量較少, 未反應(yīng)的NH2MIL結(jié)構(gòu)得以保留．

圖6是NH2BDC, NH2MIL和NH2MIL+Cys懸浮液的紫外吸收譜圖．圖6結(jié)果表明, NH2MIL+Cys懸浮液在356 nm處有較強的紫外吸收峰, 與NH2BDC紫外吸收峰一致, 這是由于懸浮液中半胱氨酸和NH2MIL中的Fe3+反應(yīng)導(dǎo)致部分配體解聚, 配體濃度增大, 紫外吸收增強．圖7是各種氨基酸加入到NH2MIL懸浮液中之后在356 nm處測試的熒光發(fā)射光譜．圖7表明, 只有加入L-Cys的NH2MIL懸浮液的熒光強度顯著增大, 熒光發(fā)射峰位于454 nm處．其他氨基酸對NH2MIL的熒光強度幾乎沒有增強, 說明NH2MIL對于半胱氨酸的熒光檢測具有較好的識別能力．

圖6 NH2BDC, NH2MIL, NH2MIL+Cys懸浮液的紫外吸收譜圖Fig.6 UV absorption spectra of NH2BDC, NH2MIL and NH2MIL+Cys suspensions

圖7 加入不同氨基酸的NH2MIL懸浮液的熒光強度對比圖Fig.7 Fluorescence intensity comparison of NH2MIL suspensions with different amino acids added

圖8是NH2MIL懸浮液熒光強度隨不同濃度的L-Cys變化曲線. 圖8結(jié)果表明, 隨著L-Cys的濃度不斷增大, 懸浮液的熒光發(fā)射強度不斷增大, 并呈現(xiàn)出一定的線性．圖9是I/I0與L-Cys濃度c之間的線性擬合方程, 其中I0和I為加入不同濃度L-Cys前后的NH2MIL懸浮液的熒光強度．圖9結(jié)果表明, 在10～200 nmol·L-1濃度范圍內(nèi)I/I0與c呈良好的線性關(guān)系, 為I/I0=0.016c+1.052 5,R2=0.999 1．檢出限為1.78 nmol·L-1．

圖8 NH2MIL懸浮液熒光強度隨不同濃度的L-Cys變化曲線Fig.8 Curve of fluorescence intensity of NH2MIL suspension with different concentrations of L-Cys

圖9 I/I0與濃度之間的線性擬合方程Fig.9 The linear fitting equation between I/I0 and concentration

圖10是NH2MIL熒光探針在其他氨基酸存在條件下的干擾實驗結(jié)果．圖10結(jié)果表明, NH2MIL在實際水樣中與L-Cys的相互作用不受其他氨基酸的干擾, 說明NH2MIL熒光探針具有良好的抗干擾能力．

使用標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測實際水樣中Cys回收率, 結(jié)果如表1所示．回收率為97.86%～98.23%(n=3), RSD小于2.0%, 表明此傳感器測試準(zhǔn)確性較高, 在實際分析中具有很大的應(yīng)用潛力．

表1 標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測水樣中的Cys的回收率結(jié)果