張玉榮,崔春曉,何雅楠,李晨杰,王殿軒,田奇生,吳 瓊

河南工業(yè)大學 糧食和物資儲備學院,糧食儲藏與安全教育部工程研究中心, 河南省糧食產后減損工程技術研究中心, 河南 鄭州 450001

花生是我國重要的油料作物和經濟作物,其富含脂肪、蛋白質、碳水化合物和鈣、鐵、鋅等微量元素以及酚類、類黃酮、白藜蘆醇等生物活性成分,經常食用可降低人們患心臟病、心血管疾病、癌癥等疾病的風險,因此在民間又被稱為“長生果”[1-3]。鮮食花生是指在莢果充實末期,果殼開始變硬時收獲,不經晾曬或干燥而直接食用或煮熟后食用的新鮮花生[4]。與普通花生相比,鮮食花生不僅因其食用方式能克服花生榨油或加工所造成的一些重要營養(yǎng)素的流失,而且口感清香且不油膩、味道鮮美,其風味深受消費者的喜歡[5]。但鮮食花生水分含量高,儲藏穩(wěn)定性差,在儲藏或銷售過程中風味易發(fā)生改變。因此開發(fā)一種方便有效的儲藏方式以延緩鮮食花生儲藏過程中的風味劣變,是推動鮮食花生產業(yè)發(fā)展的重要舉措之一。

氮氣氣調是一種能有效延緩農產品品質劣變的綠色儲藏技術[6]。胡玫等[7]研究發(fā)現氮氣氣調能有效延緩花生果儲藏期間酸價、過氧化值的升高。張來林等[8]將研究發(fā)現,在30 ℃條件下,采用98% N2氣調能有效抑制花生酸敗,而在35 ℃時不明顯。在低溫(4 ℃)下,用不同濃度的N2對鮮食花生進行氣調包裝處理,張玉榮等[9]發(fā)現90% N2處理組花生在儲藏30 d后仍能保持良好的感官品質。但關于氮氣氣調對鮮食花生儲藏過程中風味品質的影響還鮮有系統(tǒng)報道。

風味包括滋味和香氣兩個方面,上百種揮發(fā)性成分構成了花生中的香氣物質。有研究表明脂肪酸代謝是果實香氣形成的重要影響因素之一[10]?；ㄉ手胁煌舅峤M分含量的差異會對不同種類花生所制取的濃香花生油感官風味、揮發(fā)性成分及綜合指標造成影響[11]。李梓銘等[12]采用HS-SPME-GC-MS分析了茶籽油在精煉前后脂肪酸組成與揮發(fā)性風味物質成分,結果表明不飽和脂肪酸含量能有效影響茶籽油的果香風味。因此可以看出脂肪酸對花生及其制品風味的形成具有重要作用。鮮食花生脂肪含量高,且油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸含量約占其脂肪酸總量的80%,在儲藏過程中易被氧化,從而生成各種揮發(fā)性物質[13]。然而,目前關于鮮食花生儲藏過程中揮發(fā)性物質的變化及其與脂肪酸相關性的研究鮮有系統(tǒng)報道。

本試驗以鮮食花生為材料,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(SPME-GC-MS)探討90% N2處理對鮮食花生儲藏期間揮發(fā)性物質的影響,并分析其與脂肪酸的相關性,以期為科學評價氮氣氣調對鮮食花生風味品質的影響,并為加快氮氣氣調在鮮食花生實際保鮮中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮮食花生樣品(開農308)采自開封市花生合作社的農場。在播種后100 d(總生長期約為115 d),人工采摘約100 kg新鮮花生莢果,采后2 h內送到實驗室,然后挑選大小一致、無蟲害、相對飽滿的花生莢果約60 kg,用自來水沖洗表面泥土后,將其置于0.3%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min,用蒸餾水沖洗3次后在室溫下自然通風,待果殼表面晾干后進行氣調包裝。

90% N2：由N2(純度≥99.999%)和O2(純度 ≥ 99.999%)按9∶1的體積比混合制備而成,購于河南源正科技發(fā)展有限公司。PET/PE真空包裝袋：28 cm×40 cm,16絲,透氧率為380 cm3·m-2·d-1·MPa-1,水蒸氣透過率為2 g·m-2·d-1。

1.2 主要試劑

石油醚、鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉：分析純,洛陽化學試劑廠;正己烷、甲醇：色譜純,上海阿拉丁試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

FR400B手壓式塑料薄膜封口機：上海義光包裝設備制造有限公司;QP2010 Ultra氣質聯用儀：日本島津公司;7890A氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 氮氣氣調處理

將挑揀清理后的帶殼鮮食花生樣品隨機裝入PET/PE真空包裝袋中,每袋500 g,抽真空后向包裝袋中分別充入90% N2和空氣(CK),用封口機熱封后在4 ℃、RH 75%條件下避光儲藏30 d,每5 d隨機取樣1次,所有處理設3個重復。

1.4.2 脂肪酸的測定

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》歸一化法進行測定。

1.4.3 揮發(fā)性物質的測定

1.4.3.1 鮮食花生揮發(fā)性物質的提取

參考張藍月[14]使用的方法并稍做修改。取3.0 g粉碎后的鮮食花生樣品于15 mL頂空瓶中,在60 ℃下平衡30 min,然后將萃取針插入頂空瓶中萃取30 min后立刻將萃取針頭插入氣相色譜儀進樣口,在250 ℃下解析5 min后開始分析。

1.4.3.2 GC-MS分析條件

色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管色譜柱;載氣：氦氣;流速：1 mL/min,不分流;升溫程序：前進樣口溫度為 250 ℃,柱溫為50 ℃,保持 2 min,再以 7 ℃/min升至 90 ℃,保持 4 min,然后以 3.5 ℃/min 升至 170 ℃,保持 2 min;質譜接口溫度：230 ℃;質譜掃描范圍：33～300m/z;離子源：EI;離子源溫度：230 ℃;電離電壓：70 eV。

1.5 數據處理

用Microsoft Excel 2010對試驗數據進行統(tǒng)計處理,使用IBM SPSS Statistics 22.0進行單因素方差分析和主成分分析,運用Origin 2018作圖。GC-MS數據由島津軟件系統(tǒng)處理,將收集的質譜與NIST08標準質譜庫和參考化合物的保留時間進行匹配,進而對質譜結果中的揮發(fā)性物質進行鑒定,采用峰面積歸一化法計算揮發(fā)性物質的相對含量。使用在線分析網站(http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=PICRUSt_normalize)對鮮食花生的揮發(fā)性物質進行LDA Effect Size(LEfSe)分析。

2 結果與討論

2.1 氮氣氣調對鮮食花生脂肪酸的影響

氮氣氣調對鮮食花生脂肪酸的影響如表1所示。由表1可知,在儲藏過程中,鮮食花生共包含9種脂肪酸,其中油酸相對含量最高,占比在80%左右,其次是棕櫚酸和亞油酸,且其脂肪酸種類未發(fā)生改變。鮮食花生不飽和脂肪酸的相對含量隨著儲藏時間的延長呈下降的趨勢,其中亞油酸和亞麻酸下降最明顯,這與袁貝等[15]在干花生中的研究結果一致。但90% N2處理組亞油酸的相對含量在整個儲藏期間均顯著高于CK組,亞麻酸的相對含量在第20、30 天顯著高于CK組(P<0.05),儲藏30 d后,90% N2處理組亞油酸和亞麻酸的相對含量分別是CK組的1.190和1.178倍,表明90% N2處理中較低的氧氣濃度能有效抑制亞油酸和亞麻酸的氧化,這與孫強等[16]在芝麻中的研究結果一致。

表1 鮮食花生脂肪酸種類及相對含量的變化Table 1 Changes of fatty acid types and relative content in fresh edible peanuts

2.2 氮氣氣調對鮮食花生揮發(fā)性物質種類及相對含量的影響

2.2.1 鮮食花生揮發(fā)性物質的主成分分析

鮮食花生在整個儲藏期內共檢測出31種揮發(fā)性化合物(表2),其中烴類9種,醇類7種,醛類8種,酯類4種,雜環(huán)類3種。

為了全面了解氮氣氣調對鮮食花生儲藏過程中揮發(fā)性成分的影響,對所有揮發(fā)性成分數據進行了主成分分析(圖1)。由圖1可知,第1主成分的貢獻率為34.2%,第2主成分的貢獻率為23.4%,第3主成分的貢獻率為15.7%,前3個主成分的總貢獻率為73.3%,說明前3個主成分能夠較好地反映原有數據信息。在第10 天時,CK組和90% N2處理組樣品在PC2和PC3上存在明顯差異;第20 天時,CK組和90% N2處理組樣品在PC2上存在明顯差異;第30 天時,CK組和90% N2處理組樣品在PC2上存在明顯差異。主成分分析結果顯示,CK組和90% N2處理組樣品的揮發(fā)性物質在整個儲藏過程中均存在明顯差異,表明90% N2處理有效地影響了鮮食花生儲藏過程中香氣成分的變化。

圖1 鮮食花生揮發(fā)性成分的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile components in fresh edible peanuts

2.2.2 烴類物質

圖2 氮氣氣調對鮮食花生儲藏過程中烴類、醇類、醛類、酯類和雜環(huán)類物質相對含量的影響Fig.2 Effect of nitrogen modified atmosphere on the relative content of hydrocarbons, alcohols, aldehydes, esters, and heterocycles compounds in fresh edible peanuts during storage

烴類物質主要來自脂肪酸烷基自由基均裂,能反映果實脂肪酸的氧化速率[17],但其氣味閾值較高,對果實的風味影響不大[18]。氮氣氣調對鮮食花生儲藏過程中烴類物質相對含量的影響如圖2所示。由表2和圖2可知,CK組烴類物質的相對含量隨儲藏時間的延長呈快速升高的趨勢,而90% N2處理組在0～10 d緩慢下降,之后緩慢上升。CK組烴類物質的相對含量在第10、20和30 天分別為55.27%、57.49%和85.63%,較初始樣品顯著升高,且分別是90% N2處理組的9.06、2.15和2.42倍。正癸烷是初始樣品中相對含量最高的烴類物質,但隨儲藏時間的延長,其相對含量不斷降低,而2,2,4,6,6-五甲基庚烷成為CK組和90% N2處理組中相對含量最高的烴類物質。儲藏30 d后,90% N2處理組中2,2,4,6,6-五甲基庚烷的相對含量僅為CK組的41.39%。另外,除2,2,4,6,6-五甲基庚烷外,其他烴類物質的相對含量均較小。結果顯示,在儲藏過程中,鮮食花生烴類物質的相對含量呈升高的趨勢,其中2,2,4,6,6-五甲基庚烷是主要的烴類物質。90% N2處理有效抑制了鮮食花生中烴類物質的升高,表明90% N2處理能有效抑制鮮食花生中脂肪酸的氧化,這與2.1中的研究結果一致。

表2 鮮食花生揮發(fā)性物質及其相對含量Table 2 Volatile substances and their relative content in fresh edible peanuts

2.2.3 醇類物質

醇類物質主要由脂肪酸氧化產生,脂肪酸可在脂氧合酶(LOX)作用下被氧化生成氫過氧化物,然后在氫過氧化物裂解酶(HPL)的作用下生成醛類,之后經乙醇脫氫酶(ADH)催化生成醇類[10]。醇類物質的氣味閾值較高,對含脂果實的風味貢獻不大[19]。由表2和圖2可知,隨儲藏時間的延長,CK組和90% N2處理組醇類物質的相對含量均呈波動變化的趨勢,其中在第20 天時達到最高。CK組醇類物質的相對含量在第10、20、30 天分別是初始樣品的31.72%、145.42%和25.19%,90% N2處理組則分別為初始樣品的60.57%、127.83%和98.63%。桉葉油醇和正己醇是CK組和90% N2處理組中相對含量較高的醇類物質。儲藏30 d后,90% N2處理組中桉葉油醇和正己醇的相對含量是初始樣品的112.55%和110.84%,而CK組中桉葉油醇的相對含量僅為初始樣品的27.57%和37.58%。結果表明,與CK處理相比,90% N2處理有利于保持鮮食花生儲藏過程中醇類物質相對含量的穩(wěn)定。

2.2.4 醛類物質

醛類物質的氣味閾值低,對含脂果實總體風味具有重要影響[19]。Pattee等[20]研究表明己醛是鮮花生中的主要揮發(fā)性風味物質。Chetschik等[21]研究發(fā)現3-甲硫基丙醛、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪和乙酸是生花生中主要的香氣成分。謝妍純等[22]研究表明異丁醛、異戊醛、2- 甲基丁醛、苯甲醛、戊醛、己醛、檸檬烯是水煮花生中主要的香氣成分,醛類物質較多使水煮花生呈清甜香?？梢钥闯?在以上研究中花生主要的香氣成分雖然有所不同,但結果均表明醛類物質對花生的風味具有重要影響?；ㄉ南銡獬煞种饕c其品種、成熟度、水分含量、儲藏環(huán)境等因素有關[23]。由表2和圖2可知,CK組醛類物質的相對含量隨儲藏時間的延長快速下降,而90% N2處理組在0～10 d緩慢升高,之后呈緩慢下降的趨勢。在第10天和第20天時,醛類物質均是90% N2處理組中相對含量最高的揮發(fā)性成分,且在第30天時N2處理組中醛類物質相對含量僅次于烴類。90% N2處理組醛類物質的相對含量在第10、20、30 天時分別是CK組的3.44、5.03、4.15倍。在儲藏期間,90% N2處理組醛類物質的檢出數量較CK組多,其中反-2-癸烯醛和苯乙醛均只在90% N2處理組中被檢出,且它們在花生中分別呈現脂香味和果香味[24-25]。另外,在儲藏過程中,2-己烯醛、壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛是鮮食花生中相對含量較高的醛類物質。儲藏30 d后,90% N2處理組中壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛的相對含量分別是CK組的3.86、1.98、17.75、3.79倍,2-己烯醛的相對含量為1.98%,但在CK組中未檢出。壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛等醛類物質主要呈青鮮味、脂香味或花香味等[10,25]。以上研究結果顯示,在儲藏期間,鮮食花生醛類物質的相對含量總體呈下降的趨勢,但90% N2處理組醛類物質的下降速率遠低于CK組,表明90% N2處理能有效抑制鮮食花生儲藏過程中醛類物質的下降,從而抑制鮮食花生風味的變化。

2.2.5 酯類物質

C1-C10的酯類物質一般具有果香的風味,長鏈酯類則主要呈脂香味,但長鏈酯類物質的氣味閾值較高,對果實的風味影響較小[26]。酯類物質的合成主要通過兩種途徑：一種是脂肪酸在β-氧化的作用下生成酸類,之后被還原成相應的醛類和醇類,最后在醇?；D移酶(AAT)的作用下生成酯類;另一種是脂肪酸在脂氧合酶(LOX)作用下被氧化生成氫過氧化物,然后在相關酶的作用下生成醛類、醇類,最后在AAT的作用下可生成相對應的酯類[10]。由表2和圖2可知,CK組酯類物質的相對含量在0～20 d不斷升高,之后快速下降,而90% N2處理組隨儲藏時間的延長呈不斷升高的趨勢。初始樣品中未檢出酯類物質,CK組酯類物質的相對含量在第10、20、30 天分別為1.57%、3.68%、0.52%,90% N2處理組分別為2.26%、5.13%、10.80%。在儲藏期間,鮮食花生僅檢測出4種酯類物質,且相對含量均較低,其中硬脂酸乙酯和己酸乙酯僅在90% N2處理組中被檢出。對比來看,在儲藏過程中,90% N2處理組酯類物質的相對含量較CK組高,但整體來看,兩組酯類物質的相對含量均較低。CK組酯類物質的相對含量較低的原因可能是脂肪酸烷基自由基均裂導致烴類物質的相對含量過高。Chervin等[27]研究表明酯類物質的含量一般隨果實的成熟而升高,但低氧環(huán)境中會在一定程度上抑制AAT活性,進而降低酯類物質的合成。因此,推測90% N2處理組中較低的氧氣濃度可能是造成鮮食花生在儲藏過程酯類物質的相對含量較低的原因。

2.2.6 雜環(huán)類物質

由表2和圖2可知,CK組和90% N2處理組雜環(huán)類物質的相對含量在儲藏過程中均呈波動下降的趨勢。儲藏30 d后,CK組和90% N2處理組雜環(huán)類物質的相對含量分別為1.47%和3.57%。在儲藏過程中,在鮮食花生中僅檢出3種雜環(huán)類物質,且相對含量均較低。結果表明,90% N2處理對鮮食花生中雜環(huán)類物質的影響較小。

2.3 氮氣氣調條件下鮮食花生揮發(fā)性物質的LEfSe分析

LEfSe是一種基于線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)效應量(effect size)的分析方法,可以通過兩個或多個分組之間的比較,達到篩選組間具有統(tǒng)計學差異的標志物的目的[28]。采用LEfSe方法對揮發(fā)性物質進行分析時,需要進行兩步統(tǒng)計檢驗,首先進行Kruskal-Wallis秩和檢驗,檢測出具有統(tǒng)計學差異的分組,然后對具有統(tǒng)計學差異的分組之間進行Wilcoxon秩和檢驗,從而找出具有統(tǒng)計學差異的揮發(fā)性物質。LEfSe分析方法能極大地降低出現假陽性判斷的概率,目前在微生物組學Biomarker的尋找中已被廣泛應用[29]。為了更科學規(guī)范地篩選出90% N2處理組和CK組中的特征性揮發(fā)性物質,對兩組鮮食花生儲藏過程中的揮發(fā)性物質進行了LEfSe分析,結果如圖3和圖4所示。

注：內圈表示揮發(fā)性物質的種類,外圈表示某個特定的揮發(fā)性物質,圓圈的大小與揮發(fā)性物質的相對含量成正比。黃色點表示無顯著差異的揮發(fā)性物質,紅色點表示在CK組中具有關鍵作用的揮發(fā)性物質,綠色點表示在90% N2處理組中具有關鍵作用的揮發(fā)性物質。圖3 鮮食花生揮發(fā)性物質的LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis of volatile substances in fresh edible peanuts

注：LDA得分圖是基于篩選出的具有統(tǒng)計學差異的揮發(fā)性物質繪制的,LDA分數的閾值為2,柱子的顏色代表不同的分組,長短代表LDA得分。圖4 鮮食花生揮發(fā)性物質的LDA得分Fig.4 LDA score of volatile substances in fresh edible peanuts

如圖3所示,內圈中的紅色點和綠色點分別代表烴類和醛類,而另外3個黃色點順時針依次代表醇類、雜環(huán)類和酯類,表明烴類和醛類是區(qū)分CK組和90% N2處理組中揮發(fā)性物質變化的關鍵物質。從外圈看,紅色點連接的揮發(fā)性物質為正癸烷(comp1)和2,2,4,6,6-五甲基庚烷(comp5),綠色點連接的揮發(fā)性物質為桉葉油醇(comp11)、壬醛(comp18)、反-2-壬烯醛(comp19)、反,反-2,4-壬二烯醛(comp20)和鄰苯二甲酸二丁酯(comp25)。由圖4可知,綠色點連接的揮發(fā)性物質的LDA得分從高到低依次是桉葉油醇(comp11)、反,反-2,4-壬二烯醛(comp20)、鄰苯二甲酸二丁酯(comp25)、反-2-壬烯醛(comp19)、壬醛(comp18);紅色點連接的揮發(fā)性物質的LDA得分從高到低依次是2,2,4,6,6-五甲基庚烷(comp5)、正癸烷(comp1)。以上結果表明,烴類和醛類分別在CK組和90% N2處理組具有關鍵作用,其中2,2,4,6,6-五甲基庚烷和正癸烷是CK組中的特征性揮發(fā)性物質,壬醛、反-2-壬烯醛、鄰苯二甲酸二丁酯、反,反-2,4-壬二烯醛和桉葉油醇(comp11)(按LDA得分從高到低排序)是90% N2處理組中的特征性揮發(fā)性物質。

2.4 相關性分析

為了全面地了解氮氣氣調對鮮食花生采后儲藏期間揮發(fā)性成分和脂肪酸的影響,對CK組和90% N2處理組鮮食花生果實的所有揮發(fā)性成分和脂肪酸的相對含量進行了相關性分析,并根據得到的皮爾遜相關性系數(r)繪制了熱圖(圖5)。

由圖5可知,棕櫚酸與1種醇類、1種醛類呈強相關關系;硬脂酸與1種烴類、2種醇類呈強相關關系;油酸與1種烴類、2種醇類、2種醛類、3種酯類呈強相關關系;亞油酸與1種烴類、3種醛類存在強相關關系;花生酸與3種烴類、1種醇類呈強相關關系;亞麻酸與1種烴類、2種醇類、2種醛類、4種酯類呈強相關關系;山崳酸與2種烴類、2種醇類、1種醛類、2種雜環(huán)類存在強相關關系;花生四烯酸與1種醇類、1種醛類呈強相關關系;花生五烯酸與2種烴類、2種醇類、1種醛類存在強相關關系(|r|>0.8)。結果顯示,硬脂酸、花生酸、山崳酸和花生五烯酸主要與少數烴類和醇類物質相關,棕櫚酸和花生四烯酸主要與少數醇類和醛類物質相關,亞油酸主要與醛類物質相關,油酸和亞麻酸主要與醇類、醛類和酯類物質相關。可以看出,鮮食花生的脂肪酸與揮發(fā)性物質密切相關,說明脂肪酸是鮮食花生揮發(fā)性物質合成過程中重要的前體物質,這與譚卓[30]對梨的研究結果相似。

3 結論

與CK處理相比,90% N2處理能有效抑制鮮食花生中亞油酸、亞麻酸的氧化。在儲藏過程中,烴類和醛類是鮮食花生中主要的揮發(fā)性物質,其次是醇類,而酯類和雜環(huán)類物質的相對含量較小。90% N2處理能有效抑制鮮食花生儲藏過程中烴類的升高、醛類的降低,并有利于保持醇類物質的穩(wěn)定,從而有效抑制鮮食花生儲藏過程中風味的變化。LEfSe分析結果表明,2,2,4,6,6-五甲基庚烷和正癸烷是CK組中的特征性揮發(fā)性物質,鄰苯二甲酸二丁酯、桉葉油醇、反,反-2,4-壬二烯醛、反-2-壬烯醛和壬醛是90% N2處理組中的特征性揮發(fā)性物質。另外,相關性分析結果顯示鮮食花生中脂肪酸和揮發(fā)性物質在儲藏期間密切相關,說明脂肪酸是鮮食花生揮發(fā)性物質合成過程中重要的前體物質。