呂澤平,衛(wèi) 敏

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一種常見的真菌毒素,其毒性強(qiáng)、分布范圍廣,主要污染玉米、小麥、高粱、花生等糧食作物及其制品[1-2]。毒理學(xué)研究表明,OTA會對人類和動物的健康造成危害,具有很強(qiáng)的肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、致畸性等[3-4]。因此,我國對OTA在食品中的含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)GB 2761—2017的規(guī)定,谷物、豆類及其制品中的OTA最大允許限量不得超過5.0 μg/kg,葡萄酒中最大允許限量不得超過2.0 μg/kg。

目前檢測OTA的主要方法有高效液相色譜法(HPLC)[5-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7-8]、電化學(xué)法[9-10]、免疫分析方法[11-12]等。HPLC和LC-MS/MS方法具有較高的靈敏度和特異性,但往往需要昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員,復(fù)雜、耗時(shí),不利于實(shí)際應(yīng)用。電化學(xué)法因涉及電極表面頻繁修飾和納米材料對傳感效率的干擾問題,穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。免疫分析方法雖然能滿足便捷性的需求,但抗體制備煩瑣且成本相對較高,還存在假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。近年來,熒光方法因其響應(yīng)時(shí)間快、選擇性好、靈敏度高、操作簡單等特點(diǎn)而備受關(guān)注。因此,開發(fā)一種簡單、方便、高效的熒光方法用于檢測食品中的OTA是非常有價(jià)值的。

核酸適配體是可以特異性識別靶標(biāo)[13]的單鏈寡核苷酸,可以通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)體外篩選得到。與基于蛋白質(zhì)的抗體相比,核酸適配體不僅能特異性識別和結(jié)合靶標(biāo)分子,而且具有易于標(biāo)記、合成方便、成本低、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。近年來,核酸適配體已成為食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的熱門工具。Cruz-Aguado等[16]最早研究發(fā)現(xiàn)了可以特異性識別OTA分子的單鏈核苷酸。OTA核酸適配體的發(fā)現(xiàn)為構(gòu)建適配體傳感器檢測OTA提供了可能。

作者采用熒光方法,使用羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的核酸適配體(Apt-FAM)特異性識別OTA,依據(jù)NUPACK軟件模擬結(jié)果,通過對不同互補(bǔ)DNA核酸序列的篩選,構(gòu)建了快速、簡單的熒光傳感器,實(shí)現(xiàn)對食品中OTA的檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核酸序列：生工生物工程(上海)有限公司,標(biāo)記FAM的OTA核酸適配體與其互補(bǔ)鏈的DNA序列(cDNA)見表1。OTA、AFB1、DON：Sigma-Aldrich公司;FB1：Acros公司;T-2毒素：生工生物工程(上海)股份有限公司;ZEN：國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院提供。葡萄酒：市售。

表1 試驗(yàn)使用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this experiment

氯化鈉(NaCl)和鹽酸(HCl)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tirs)：上海麥克林生化科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)：洛陽化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Cary Eclipse EL06953220熒光光譜儀：美國瓦里安公司;MX-S渦旋振蕩器：北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HC-2066高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;ULUP-II-10T超純水機(jī)：西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熒光傳感器的制備及OTA的檢測

將10 μL 1 μmol/L Apt-FAM 探針與10 μL 1 μg/mL 的OTA溶液加入200 μL的離心管中,渦旋振蕩混合均勻,在37 ℃條件下,置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)孵育30 min,之后加入10 μL 1 μmol/L cDNA-BHQ1,繼續(xù)孵育30 min。孵育完成后,使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將溶液體積補(bǔ)充至200 μL,使用熒光分光光度計(jì)記錄混合溶液在490 nm激發(fā)波長下的熒光強(qiáng)度。

1.3.2 實(shí)際樣品處理

將玉米樣品研磨成粉后取出0.5 g,分別加入0.5 mL不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)液,室溫干燥后,加入5 mL的萃取溶劑(甲醇與水體積比7∶3),振蕩30 min后,以12 000 r/min離心10 min,用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾獲得上清液。使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將濾液稀釋100倍。根據(jù)上述方法,分別制備出含有0、0.5、5、50 ng/mL的加標(biāo)玉米粉樣品。

取0.5 mL葡萄酒樣品,分別加入0.5 mL不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)液,混合均勻,用0.45 μm水系濾膜過濾獲得上清液。使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將濾液稀釋100倍。根據(jù)上述方法,分別制備出含有0、0.5、5、50 ng/mL的加標(biāo)葡萄酒樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Originpro 2021軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),使用Adobe Illustrator 2022軟件繪制原理圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)原理

基于標(biāo)記有熒光探針FAM的OTA適配體,與標(biāo)記有猝滅基團(tuán)BHQ1的cDNA互補(bǔ)鏈,設(shè)計(jì)了熒光適配體均相傳感器用于OTA的檢測研究,檢測原理如圖1所示。當(dāng)OTA不存在時(shí),Apt-FAM與cDNA-BHQ1通過堿基互補(bǔ)配對相結(jié)合,形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu),熒光基團(tuán)FAM靠近猝滅基團(tuán)BHQ1,在熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用下,Apt-FAM鏈上標(biāo)記的熒光基團(tuán)被cDNA-BHQ1上標(biāo)記的猝滅基團(tuán)BHQ1猝滅[17-18],得到較弱的熒光信號。當(dāng)OTA存在時(shí),Apt-FAM適配體鏈會與OTA特異性結(jié)合,形成G-四鏈體單鏈結(jié)構(gòu),不會通過堿基互補(bǔ)配對與cDNA-BHQ1形成雙鏈,FAM的熒光不會被BHQ1猝滅,熒光信號恢復(fù),與Liu等[19]的研究結(jié)果一致。

圖1 熒光傳感器檢測OTA的原理Fig.1 Principle of OTA detection by fluorescence sensor

2.2 熒光傳感器用于OTA檢測

圖2 傳感器的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of the sensor

利用所制備的熒光傳感器對OTA進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有OTA存在時(shí),測得的熒光信號值較低(曲線a),最高為80.97 a.u.。這說明Apt-FAM與cDNA1-BHQ1成功形成雙鏈結(jié)構(gòu),FAM的熒光信號成功被BHQ1猝滅。當(dāng)OTA存在時(shí),熒光信號值(曲線b)明顯升高至182.91 a.u.,與不含OTA的情況相比,響應(yīng)信號值增加了1.3倍。這說明了Apt-FAM適配體鏈能夠與OTA特異性結(jié)合,帶有FAM熒光基團(tuán)的適配體鏈遠(yuǎn)離cDNA-BHQ1,FAM熒光基團(tuán)不會被BHQ1猝滅,因而熒光信號較高。結(jié)果表明本試驗(yàn)所構(gòu)建的熒光傳感器能夠成功檢測OTA。

2.3 核酸適配體互補(bǔ)DNA序列的優(yōu)化

依據(jù)NUPACK軟件模擬結(jié)果(圖3),選取了3條不同長度、位置的互補(bǔ)序列cDNA1-BHQ1、cDNA2-BHQ1、cDNA3-BHQ1。cDNA1-BHQ1和cDNA2-BHQ1均從Apt-FAM的3′端與其互補(bǔ),分別互補(bǔ)了18、12個(gè)堿基,其吉布斯自由能分別為-105.60 kJ/mol和-74.06 kJ/mol。cDNA3-BHQ1與Apt-FAM從距其3′端第13個(gè)堿基開始互補(bǔ)(即中間互補(bǔ)),互補(bǔ)了12個(gè)堿基,其吉布斯自由能為-74.43 kJ/mol。按照1.3.1試驗(yàn)步驟分別構(gòu)建相應(yīng)的傳感器,對OTA進(jìn)行熒光檢測,依據(jù)背景信號熒光強(qiáng)度和整體相對熒光強(qiáng)度的差值(ΔF),選取了最適互補(bǔ)序列,結(jié)果如圖4和圖5所示。由圖4可知,與cDNA2-BHQ1和cDNA3-BHQ1相比,cDNA1-BHQ1參與反應(yīng)時(shí),背景信號熒光強(qiáng)度最低,說明互補(bǔ)鏈與適配體互補(bǔ)18個(gè)堿基時(shí),兩條鏈能夠更好地結(jié)合,使FAM的熒光信號被BHQ1猝滅。試驗(yàn)結(jié)果與NUPACK軟件模擬結(jié)果相一致,即兩條DNA鏈結(jié)合時(shí),吉布斯自由能越小,親和力越高,結(jié)合越穩(wěn)定[20]。圖5顯示了有無目標(biāo)物存在時(shí)的ΔF,當(dāng)cDNA1-BHQ1參與反應(yīng)時(shí),ΔF最大。因此,在3條DNA序列中,選擇cDNA1-BHQ1作為互補(bǔ)鏈參與反應(yīng),進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 Apt與不同cDNA形成的二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure diagram of Apt and different cDNA formation

圖4 不同cDNA對應(yīng)的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra corresponding to the different cDNA

圖5 不同cDNA對傳感器ΔF的影響Fig.5 Effect of different cDNA on the ΔF of the sensor

2.4 傳感器結(jié)合方式的優(yōu)化

選取了兩種不同的結(jié)合方式對傳感器進(jìn)行優(yōu)化。方式1是將Apt-FAM與OTA、cDNA1-BHQ1同時(shí)加入,孵育60 min后進(jìn)行熒光測定;方式2是將Apt-FAM與OTA先孵育30 min,再加入cDNA1-BHQ1孵育30 min后進(jìn)行熒光測定。圖6為兩種不同結(jié)合方式對應(yīng)的熒光光譜圖,由圖6可知,方式1和方式2的背景信號基本相同,但加入OTA后,方式2的熒光信號最大值上升幅度明顯高于方式1,是其1.30倍,說明OTA先與Apt-FAM結(jié)合時(shí),結(jié)合效果更好,其阻礙了Apt-FAM與cDNA-BHQ1結(jié)合,使熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)減弱,從而獲得了更高的熒光信號。因此,選擇方式2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 不同結(jié)合方式對應(yīng)的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra corresponding to the different binding methods

2.5 孵育時(shí)間的優(yōu)化

對傳感器的孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,其他試驗(yàn)條件與1.3.1一致,將Apt-FAM與OTA先孵育10、15、30、45、60 min,再加入cDNA1-BHQ1孵育10、15、30、45、60 min,即傳感器的總孵育時(shí)間分別為20、30、60、90、120 min。孵育完成后進(jìn)行熒光測定,比較ΔF,選取最適孵育時(shí)間。由圖7可知,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,ΔF逐漸增大,將Apt-FAM與OTA先孵育30 min,再加入cDNA1-BHQ1孵育30 min后,ΔF達(dá)到最大,為107.43 a.u.。之后,隨著孵育時(shí)間的延長,ΔF無明顯變化。因此,總孵育時(shí)間為60 min為最佳孵育時(shí)間繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖7 不同孵育時(shí)間對傳感器ΔF的影響Fig.7 Effect of different incubation time on the ΔF of the sensor

2.6 cDNA與Apt用量比的優(yōu)化

圖8 不同cDNA與Apt用量比對傳感器ΔF的影響Fig.8 Effects of different dosage ratios of cDNA and Apt on the ΔF of the sensor

為了獲得傳感器的最佳性能,對cDNA與Apt的用量比進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果如圖8所示。當(dāng)OTA存在時(shí),保持Apt用量不變,隨著cDNA用量的增加,ΔF逐漸增大,并在cDNA與Apt用量比為1.0(1∶1)的情況下達(dá)到最大值;當(dāng)cDNA的用量繼續(xù)增大時(shí),ΔF略有下降。因此,選擇cDNA與Apt用量比為1∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.7 反應(yīng)體系pH值的優(yōu)化

反應(yīng)體系的pH值會影響DNA鏈的穩(wěn)定性,因此對體系的pH值進(jìn)行了優(yōu)化。由圖9可知：當(dāng)OTA存在時(shí),隨著Tris-HCl緩沖溶液的pH值從6.6開始增大,ΔF也逐漸增加,并在pH 7.4時(shí)達(dá)到最大值;隨著Tris-HCl緩沖溶液的pH值繼續(xù)增大,ΔF略有下降,因此選擇pH 7.4作為整個(gè)試驗(yàn)的最優(yōu)pH值。

圖9 不同pH值對傳感器ΔF的影響Fig.9 Effects of different pH values on the ΔF of the sensor

2.8 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳檢測條件下,測定OTA不同質(zhì)量濃度( 0、0.05、0.5、1、5、10、50、100、200 ng/mL)熒光傳感器的熒光強(qiáng)度,研究ΔF與OTA質(zhì)量濃度之間的關(guān)系,并根據(jù)相關(guān)性建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖10可知,在0.5～100 ng/mL的線性范圍內(nèi),隨著OTA質(zhì)量濃度的增加,ΔF也隨之增加,并且在對OTA質(zhì)量濃度取對數(shù)后,兩者具有良好的線性相關(guān)關(guān)系,線性方程為y=31.934 98+41.714 94lg(COTA),決定系數(shù)R2=0.997,檢出限為0.13 ng/mL。本試驗(yàn)所制備的傳感器與其他文獻(xiàn)的線性范圍和檢出限比較如表2所示。由表2可知,本試驗(yàn)所制備的傳感器的線性范圍更廣,檢出限更低,所制備的傳感器檢出限雖不及電化學(xué)方法,但檢測范圍優(yōu)于電化學(xué)方法。此外,傳感器的制備時(shí)間較短,優(yōu)于表2中的其他傳感器,可以達(dá)到更快速檢測OTA的目的。

圖10 不同質(zhì)量濃度OTA與ΔF的關(guān)系Fig.10 Different mass concentrations of OTA with ΔF

2.9 傳感器特異性研究

選取黃曲霉毒素B1(AFB1)、伏馬菌素B1(FB1)、T-2毒素、玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)作為干擾物質(zhì),進(jìn)行傳感器的特異性研究,所用OTA的質(zhì)量濃度為50 ng/mL,其他干擾毒素的質(zhì)量濃度均為500 ng/mL,結(jié)果如圖11所示。由圖11可知：單一的其他干擾毒素對ΔF影響很小;當(dāng)其他干擾毒素與OTA共存(Mix)時(shí),ΔF與空白相比明顯上升,且與OTA單獨(dú)存在時(shí)的ΔF無明顯差異。說明該傳感器對檢測OTA有良好的特異性。

表2 本方法與其他檢測OTA的方法比較Table 2 Comparison of this method with other methods for detecting OTA

注：Mix是含有AFB1、FB1、T-2、ZEN、DON、OTA的樣品。圖11 不同毒素對傳感器特異性的影響Fig.11 Effects of different toxins on sensor specificity

2.10 實(shí)際樣品檢測

為了驗(yàn)證傳感器在實(shí)際樣品中的檢測效果,對玉米粉、葡萄酒樣品進(jìn)行了加標(biāo)檢測,結(jié)果如表3所示。玉米粉樣品和葡萄酒樣品的平均回收率分別為100.0%～102.0%和98.0%～102.2%,RSD均低于10%,表明該傳感器對實(shí)際樣品的檢測具有較高的準(zhǔn)確性。

表3 玉米粉和葡萄酒中OTA的加標(biāo)檢測 (n=3)Table 3 Spike detection of OTA in corn flour and wine (n=3)

2.11 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了驗(yàn)證傳感器的重現(xiàn)性,選擇OTA的質(zhì)量濃度為50 ng/mL,在最佳檢測條件下,進(jìn)行了6次平行試驗(yàn),記錄熒光強(qiáng)度,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%。由此可知,該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將傳感器在4 ℃下儲存,分別測試了第1天、第4天、第7天、第10天、第14天的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖12所示?？梢钥闯?隨著儲存時(shí)間延長,熒光強(qiáng)度稍有下降,第14天的熒光強(qiáng)度下降了9.32%,保留率為90.68%,表明該傳感器具有可接受的穩(wěn)定性。

圖12 傳感器的穩(wěn)定性Fig.12 Stability of the sensor

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用核酸適配體作為特異性識別元件,FAM作為熒光探針,cDNA1-BHQ1為最佳互補(bǔ)鏈,成功制備了用于檢測OTA的熒光傳感器,該傳感器制備簡單、特異性好,具有可接受的重現(xiàn)性,能實(shí)現(xiàn)對OTA的快速檢測。對玉米粉和葡萄酒進(jìn)行加標(biāo)檢測,具有較好的回收率,說明該傳感策略可被成功應(yīng)用于食品中OTA的檢測。此外,本試驗(yàn)所構(gòu)建的傳感器還具有潛在的通用性,可以將識別元件更換為其他真菌毒素的適配體,從而實(shí)現(xiàn)對其他真菌毒素的快速檢測,為快速檢測食品中真菌毒素提供了一種新的思路。