賈筱沄，邢耀春，馬曉靜，李愷球，卓志斌，吳君俠，楊文釗，曾令瑜，趙巖，王宇寧，李志紅

（1.中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院生物安全系，北京 100089；2.安徽省植物保護總站，合肥 230091；3.太湖縣種植業(yè)服務(wù)中心，安徽 安慶 246400；4.鳳陽縣植保站，安徽 滁州 233100；5.碭山縣植保植檢服務(wù)中心，安徽 宿州 235300）

實蠅是雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae）昆蟲，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，約有500 屬4 500種，其中具有重要經(jīng)濟意義的實蠅約有250 余種［1，2］。柑橘大實蠅（Bactrocera minax）屬雙翅目實蠅科果實蠅屬，是柑橘類果樹的重要害蟲，主要分布于中國西南地區(qū)和印度次大陸北緣。該害蟲生物學特性獨特，一年發(fā)生一代，僅為害柑橘類果實，雌成蟲產(chǎn)卵于幼果內(nèi)，造成果皮傷口，病原菌易從傷口入侵果實，幼蟲孵化后取食果肉造成危害，使果實完全失去食用價值和經(jīng)濟價值。柑橘大實蠅在中國西南地區(qū)具有明顯的擴散趨勢，主要以幼蟲隨被害果實沿河谷向下游遠距離擴散和以成蟲飛行向周邊短距離擴散為主。隨著氣候變化、種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和水果貿(mào)易增加，其危害面積逐漸擴大，自20 世紀60 年代，疫情呈逐年加重趨勢［3，4］。目前，對昆蟲的物種鑒定多采用形態(tài)學方法，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法存在一定缺陷，如果遇到昆蟲卵、幼蟲和蛹以及在保存、運輸過程中出現(xiàn)肢體殘缺或磨損的情況，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法很難辨別，鑒定較困難［5］。

隨著分子生物學的發(fā)展，利用分子生物學技術(shù)進行昆蟲物種鑒定，不受昆蟲的蟲態(tài)約束，可以從分子生物學水平得到準確的物種信息，該技術(shù)是傳統(tǒng)昆蟲形態(tài)學鑒定的合理補充［6，7］。其中，DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）被認為是最簡單、迅速、精確的方法。2003年，Herbert等［8］提出DNA 條形碼技術(shù)的概念，即利用一段標準的DNA 序列作為標記，通過序列分析，快速準確地進行物種鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，利用線粒體DNA 細胞色素C 氧化酶I 基因（COI）中一段長度為658 bp 的片段，能夠成功地在DNA 水平上區(qū)分動物物種，該片段被作為動物物種鑒定的DNA 條形碼。目前，該鑒定技術(shù)的有效性已經(jīng)在包括昆蟲綱在內(nèi)的多個動物類群中得到證明，可以根據(jù)序列相似性和遺傳距離對物種進行準確鑒定，同時在發(fā)現(xiàn)和描述新種或隱種、分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育等研究中廣泛應(yīng)用。

目前該技術(shù)在實蠅鑒定方面也多有報道。2011年，Buahom等［9］采用DNA 條形碼技術(shù)，將采自泰國四色菊市番石榴爛果中的5 頭實蠅幼蟲的COI序列進行擴增測序，使用BOLD（Barcode of life data system）數(shù)據(jù)庫比對及PAUP 4.0 軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹，成功鑒定幼蟲為番石榴果實蠅，并將2條COI序列在GenBank 中注冊。2017年，Guo等［10］利用DNA條形碼技術(shù)快速準確地鑒定了枸杞實蠅的幼蟲和蛹。2018年，王溪橋等［11］結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學方法和DNA 條形碼技術(shù)，擴增具條實蠅和南瓜實蠅的COI基因，基因擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后與NCBI（National center for biotechnology information）及BOLD 數(shù)據(jù)庫比對，并進行物種鑒定。2019年，趙巖等［12］使用DNA條形碼技術(shù)，對采自河南省洛陽市、鄭州市的實蠅幼蟲、成蟲進行分子鑒定。DNA 條形碼技術(shù)操作簡便，能克服非成蟲蟲態(tài)鑒定難的問題，可使非昆蟲分類人員或昆蟲分類經(jīng)驗較少的人員快速精確地完成目標物種鑒定工作［13］。

相較于需測序、拼接、剪切的DNA 條形碼技術(shù)，同樣以COI基因為基礎(chǔ)開發(fā)的PCR 技術(shù)也廣受關(guān)注。2013年，程曉甜等［14］通過SYBR green 實時熒光PCR 快速鑒定技術(shù)建立了棗實蠅鑒定方法。2014年，黃振等［15］設(shè)計種特異性引物，通過PCR 方法將辣椒實蠅與其他20 種實蠅進行區(qū)別。2019年，Zheng等［16］通過分析中國10 種檢疫性實蠅不同地理種群的COI基因序列，設(shè)計出一對可以用于區(qū)分柑橘大實蠅與蜜柑大實蠅的特異性PCR 引物。

本研究對來自安徽省太湖縣天花鎮(zhèn)的5 頭實蠅幼蟲進行DNA 條形碼序列擴增與測序，與BOLD 數(shù)據(jù)庫中DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫的序列進行比對及系統(tǒng)發(fā)育分析。同時，本研究使用Zheng等［16］針對柑橘大實蠅與蜜柑大實蠅設(shè)計的特異引物（Bm-F/R、Bt-F/R），對實蠅幼蟲樣本進行物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究于2020 年10 月4 日在安徽省太湖縣天花鎮(zhèn)（30°29′19″N，116°08′37″E）種植的溫州蜜柑“日南1 號”的果實中采集5 頭實蠅幼蟲。將實蠅幼蟲樣本按THA1、THA2、THA3、THA4、THA5 的順序編號后，置于含有無水乙醇的離心管，-80 ℃保存。

血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；COI基因片段純化和雙向測序，北京六合華大基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 以整頭實蠅幼蟲為材料，使用血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒進行全基因組DNA 提取。

1.2.2 DNA 條形碼序列擴增與PCR 特異引物鑒定 使用Folmer等［17］設(shè)計的引物（LCO-1490/HCO-2198）擴增線粒體基因組中COI基因的DNA 條形碼序列（658 bp），使用引物（Bm-F/R、Bt-F/R）擴增實蠅幼蟲樣本的特異片段（422 bp），引物序列見表1。

表1 COI基因LCO-1490/HCO-2198 通用引物及Bm-F/R、Bt-F/R 特異性引物序列

PCR 反應(yīng)的總體積為25 μL，2×TaqPCR Master-Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物，在含0.01% GeneGreen 核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測（120 V，20 min）。

將使用LCO-1490 和HCO-2198 引物得到的PCR 擴增產(chǎn)物進行基因片段純化和雙向測序。分別將使用Bm-F/R、Bt-F/R 引物得到的PCR 擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。

1.2.3 序列比對及分析 測序結(jié)果返回后，使用MEGA X軟件對得到的正反向測序結(jié)果進行拼接［18］，得到單條準確序列。采用BOLD 數(shù)據(jù)庫中的Identification-animal identification［COI］功能對每條DNA 條形碼序列進行比對，檢查鑒定結(jié)果及相似度數(shù)據(jù)。

選取蜜柑大實蠅（Bactrocera tsuneonis）、南亞果實蠅（Zeugodacus tau）、番石榴果實蠅（Bactrocera correcta）、瓜實蠅（Zeugodacus cucurbitae）、具條實蠅（Zeugodacus scutellatus）及橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）為相關(guān)近似種，家蠅（Musca domestica）為外族，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)物種的DNA 條形碼序列，使用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以進一步確定分子鑒定的結(jié)果。采用鄰接法（NJ）構(gòu)建實蠅幼蟲樣本序列與相關(guān)種類標準序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支設(shè)置信度（Bootstrap），迭代1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 條形碼序列及相似性鑒定

測序得到長度為655 bp的COI基因序列，上傳并獲得GenBank 登錄號。將5 頭實蠅幼蟲樣本的COI基因序列與BOLD 數(shù)據(jù)庫中DNA 條形碼序列進行比對，分子鑒定結(jié)果（表2）顯示，5 頭實蠅幼蟲樣本的DNA 條形碼序列與BOLD 數(shù)據(jù)庫中柑橘大實蠅標準序列的相似性均為100%。

表2 實蠅幼蟲樣本COI基因序列基本信息及相似性比對結(jié)果 （單位：%）

2.2 系統(tǒng)進化樹分析

使用MAGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1），實蠅幼蟲樣本序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的柑橘大實蠅序列形成一個單系，且與其近緣物種顯著區(qū)分開，確定實蠅幼蟲樣本為柑橘大實蠅。

圖1 MAGA-X 軟件構(gòu)建的實蠅幼蟲樣本系統(tǒng)進化樹

2.3 PCR 鑒定

由圖2 可知，使用蜜柑大實蠅特異引物得到的PCR 產(chǎn)物無條帶產(chǎn)生，說明5 頭實蠅幼蟲樣本不是蜜柑大實蠅；使用柑橘大實蠅特異引物得到的PCR產(chǎn)物在300～500 bp 有清晰明亮的條帶，擴增序列長度符合特異引物擴增序列長度特征（422 bp），說明實蠅幼蟲樣本為柑橘大實蠅。

圖2 Bm-F/R、Bt-F/R 引物PCR 擴增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究使用DNA 條形碼技術(shù)，通過基因序列測定、比對分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，明確了安徽省太湖縣天花鎮(zhèn)的5 頭幼蟲為柑橘大實蠅。相關(guān)實蠅幼蟲DNA 條形碼序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫，可作為標準序列應(yīng)用于今后的實蠅DNA 條形碼鑒定。使用特異引物組（Bm-F/R、Bt-F/R）對實蠅幼蟲樣本進行鑒定，鑒定結(jié)果與DNA 條形碼鑒定結(jié)果一致。相較于DNA 條形碼技術(shù)，使用特異性引物的PCR 鑒定技術(shù)無需測序，可快速得到結(jié)果，省時省力，成本更低。但該引物組僅對柑橘大實蠅和蜜柑大實蠅的區(qū)分鑒定有效，不能鑒定其他物種。DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用范圍更廣，使用一對通用引物即可滿足物種鑒定的需求，該技術(shù)操作流程簡單，應(yīng)推進該鑒定技術(shù)的標準化，加快該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

柑橘大實蠅已在中國多個省份有所分布［4］。本研究在安徽省發(fā)現(xiàn)柑橘大實蠅活動蹤跡，表明柑橘大實蠅擴散趨勢顯著，潛在風險較高，安徽省柑橘類作物主產(chǎn)區(qū)應(yīng)加強監(jiān)測預(yù)警，防止柑橘大實蠅擴散。太湖縣位于安徽省、湖北省、江西省3 省交界處，周邊省份柑橘大實蠅非疫區(qū)也應(yīng)加強監(jiān)測，防止柑橘大實蠅擴散傳播。

隨著DNA 條形碼技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)在中藥材真假判別、動植物檢疫等方面也有諸多運用［19］。本研究實現(xiàn)了柑橘大實蠅幼蟲的精準、快速鑒定，顯示了DNA 條形碼技術(shù)具有快速準確的特點。同時，本研究應(yīng)用針對柑橘大實蠅與蜜柑大實蠅設(shè)計的特異性引物，經(jīng)濟、高效地獲得了待測樣本的物種信息。