李 悅,郝艷麗,吳 濤

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是一種常見(jiàn)的心血管疾病,其特征為心肌組織血液供應(yīng)減少,血液供應(yīng)恢復(fù)導(dǎo)致缺血組織的繼發(fā)性損傷[1]。目前,I/R損傷是導(dǎo)致缺血性心臟病病人高死亡率的重要原因。I/R損傷機(jī)制復(fù)雜,其中細(xì)胞內(nèi)過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞凋亡相關(guān),對(duì)心肌組織損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有直接影響[2]。因此,提高心肌細(xì)胞抗氧化反應(yīng)能力、減輕細(xì)胞凋亡可能是預(yù)防I/R損傷的有效方法。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的新型非編碼RNA,其通過(guò)在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),參與自噬、氧化應(yīng)激損傷、凋亡等多種病理過(guò)程[3-5]。研究表明,神經(jīng)元細(xì)胞HT-22糖氧剝奪損傷模型中l(wèi)ncRNA橫紋肌肉瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄物-2(rhabdomyosarcoma 2-associated transcript,RMST)表達(dá)上調(diào),抑制lncRNA RMST表達(dá)可提高HT-22細(xì)胞存活率,減輕糖氧剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。lncRNA RMST表達(dá)下調(diào)還可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,降低炎癥反應(yīng),減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷[7]。序列分析發(fā)現(xiàn),miR-224-3p含有l(wèi)ncRNA RMST結(jié)合位點(diǎn),miR-224-3p可抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡,對(duì)腦I/R損傷具有保護(hù)作用[8]。然而lncRNA RMST、miR-224-3p在心肌細(xì)胞I/R損傷中的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究建立缺氧復(fù)氧(H/R)細(xì)胞模型,探討lncRNA RMST和miR-224-3p在心肌損傷中的作用,以期為防治心肌I/R損傷提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人心肌細(xì)胞株(HCM)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)液、Lipofectamine 3000、TRizol試劑、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司;青鏈霉素雙抗溶液、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技公司;miR-224-3p模擬物(miR-224-3p mimics)、模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-224-3p抑制物(anti-miR-224-3p)、抑制物陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、RMST小干擾RNA(si-RMST)、陰性對(duì)照序列(si-NC)以及雙熒光素酶報(bào)告載體均由上海吉瑪制藥公司提供;逆轉(zhuǎn)錄酶、2×SYBR Green master mix購(gòu)于大連Takara生物公司;膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)購(gòu)于上海鈺博生物公司;兔B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma -2,Bcl-2)多克隆抗體、兔Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl associated X protein,Bax)單克隆抗體、兔磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)于上海碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建心肌細(xì)胞H/R模型 HCM細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時(shí),0.25%的胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)期心肌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照梁冰等[9]的方法構(gòu)建H/R模型。缺氧處理前將細(xì)胞培養(yǎng)液中通入5%CO2、95%N2使其成為缺氧培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱(含5%CO2、95%N2)中37 ℃培養(yǎng)3 h,然后更換為新鮮培養(yǎng)液,置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱(含5%CO2、95%空氣)中37 ℃培養(yǎng)3 h。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)染前1 d,取2×105個(gè)對(duì)數(shù)期HCM細(xì)胞接種于24孔板;轉(zhuǎn)染當(dāng)天,用50 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋待轉(zhuǎn)染的序列片段,并輕輕混勻,室溫靜置5 min;用50 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000,室溫靜置5 min;將Lipofectamine 3000和待轉(zhuǎn)染序列片段的稀釋液混合,室溫靜置20 min。將上述混合液加到培養(yǎng)板各孔內(nèi),培養(yǎng)6～8 h后更換為新鮮培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)染48 h時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行H/R處理。根據(jù)轉(zhuǎn)染序列片段不同分為H/R+si-NC組、H/R+si-RMST組、H/R+miR-NC組、H/R+miR-224-3p mimics組、H/R+si-RMST+anti-miR-NC組、H/R+si-RMST+anti-miR-224-3p組。正常培養(yǎng)的HCM細(xì)胞作為對(duì)照組,H/R模型細(xì)胞作為H/R模型組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA RMST和miR-224-3p相對(duì)表達(dá)量 使用TRizol試劑從各組細(xì)胞中分離總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄酶、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將cDNA稀釋20倍作為擴(kuò)增模板。配制20 μL反應(yīng)體系,包括2×SYBR Green master mix 10 μL、cDNA模板2 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL,補(bǔ)加雙蒸水至20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環(huán)40次。RMST正向引物5′-AGCAATGCATTCTTTCACATGG-3′,反向引物5′-ATGCAATTTCGGTGGTTGGC-3′;GAPDH正向引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′,反向引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′;miR-224-3p正向引物5′-AGTCTCTGGCTGAC TACATCACAG-3′,反向引物5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′;U6正向引物5′-CCCTGGCACCCAGCAC-3′,反向引物5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次后,用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞獲得細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液,分別加入5 μL Annexin V-FITC,充分混勻,避光孵育15 min,再加入5 μL PI,室溫避光孵育5 min,補(bǔ)加1×結(jié)合緩沖液390 μL。混勻后,立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞活力 每組取5×106個(gè)HCM細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)48 h后向各孔內(nèi)加入CCK-8溶液10 μL,室溫反應(yīng)2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的光密度值(OD)。存活率=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD。

1.2.6 MDA含量、SOD和GSH-Px活性及LDH釋放量檢測(cè) HCM細(xì)胞處理完畢后,分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞。LDH檢測(cè)試劑盒分析培養(yǎng)液上清中LDH活性。取各組HCM細(xì)胞,采用細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min,4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min,收集上清液,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MDA含量、SOD和GSH-Px活性,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量 RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白,隨后進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合均勻100 ℃煮5 min至蛋白變性。冷卻至室溫后,取30 μg蛋白上樣至各加樣孔進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)移至凝膠底部時(shí)終止電泳。利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶4 ℃封閉過(guò)夜。用1∶1 000稀釋的一抗溶液室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min;用1∶1 000稀釋的二抗溶液室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。用化學(xué)發(fā)光顯色試劑進(jìn)行顯影,曝光后,圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析,結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將含有miR-224-3p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA RMST野生型(WT)序列或突變型(MUT)序列克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,獲得雙熒光素酶報(bào)告載體WT-RMST、MUT-RMST。參照1.2.2步驟將WT-RMST、MUT-RMST分別與miR-224-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞并測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。同時(shí)分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-RMST、si-NC、si-RMST至心肌細(xì)胞,48 h后按照RT-qPCR步驟測(cè)定miR-224-3p相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA RMST和miR-224-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與對(duì)照組比較,H/R模型組心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA RMST表達(dá)明顯升高,miR-224-3p表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 lncRNA RMST和miR-224-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)(±s)

2.2 抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞存活的影響 與對(duì)照組比較,H/R模型組心肌細(xì)胞RMST表達(dá)、MDA含量、LDH釋放量明顯升高,SOD、GSH-Px活性、細(xì)胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H/R+si-NC組比較,H/R+si-RMST組心肌細(xì)胞RMST表達(dá)、MDA含量、LDH釋放量明顯降低,SOD、GSH-Px活性、細(xì)胞存活率明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞存活的影響(±s)

2.3 抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較,H/R模型組心肌細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H/R+si-NC組比較,H/R+si-RMST組心肌細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖1、圖2。

表3 抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響(±s)

圖1 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

圖2 細(xì)胞凋亡流式圖

2.4 lncRNA RMST靶向調(diào)控miR-224-3p的表達(dá) LncBase Predicted v.2數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析顯示,lncRNA RMST含有與miR-224-3p互補(bǔ)的核苷酸序列(見(jiàn)圖3)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,miR-224-3p mimics和WT-RMST共轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性較miR-NC和WT-RMST共轉(zhuǎn)染組明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而miR-224-3p mimics和MUT-RMST共轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與miR-NC和MUT-RMST共轉(zhuǎn)染組比較無(wú)明顯變化。RT-qPCR檢測(cè)顯示,pcDNA-RMST組心肌細(xì)胞miR-224-3p表達(dá)較pcDNA組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);si-RMST組心肌細(xì)胞miR-224-3p表達(dá)較si-NC組明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

表5 lncRNA RMST調(diào)控miR-224-3p的表達(dá)(±s)

2.5 miR-224-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-224-3p組miR-224-3p的表達(dá)水平明顯升高,細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量、LDH釋放量明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、SOD和GSH-Px活性、細(xì)胞存活率明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表6、圖4、圖5。

表6 miR-224-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響(±s)

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

圖5 細(xì)胞凋亡流式圖

2.6 干擾miR-224-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 與H/R+si-RMST+anti-miR-NC組比較,H/R+si-RMST+anti-miR-224-3p組心肌細(xì)胞miR-224-3p表達(dá)水平明顯降低,細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量、LDH釋放量明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、SOD和GSH-Px活性、細(xì)胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表7、圖6、圖7。

表7 干擾miR-224-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用(±s)

圖6 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

圖7 細(xì)胞凋亡流式圖

3 討 論

心肌細(xì)胞I/R損傷可導(dǎo)致充血性心力衰竭、惡性心律失常,嚴(yán)重威脅人類生命健康[10]。因此,積極探索與心肌細(xì)胞I/R損傷有關(guān)的基因,分析其潛在作用和可能機(jī)制,對(duì)治療心肌I/R損傷有重要意義。lncRNA RMST在糖氧剝奪誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞損傷、大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的腦損傷以及缺血性腦卒中病人血漿中表達(dá)明顯升高,抑制lncRNA RMST表達(dá)對(duì)神經(jīng)元損傷、缺血性腦損傷具有保護(hù)作用,腦內(nèi)注射RMST干擾載體還可減少小腦梗死面積和改善神經(jīng)功能[11-12]。lncRNA RMST高表達(dá)促進(jìn)氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,抑制lncRNA RMST可能是保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧缺血損傷的相關(guān)機(jī)制[13-14]。本研究顯示,H/R誘導(dǎo)后HCM細(xì)胞中l(wèi)ncRNA RMST表達(dá)明顯升高、細(xì)胞凋亡率明顯升高、存活率下降。Bcl-2/Bax比值是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要因素,Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低可促進(jìn)線粒體膜通透性孔開(kāi)放,并隨后釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、Caspases激活因子,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。與功能分析結(jié)果一致,抑制lncRNA RMST表達(dá)可減輕H/R誘導(dǎo)對(duì)HCM細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的促進(jìn)和Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),H/R誘導(dǎo)后HCM細(xì)胞上清液中MDA含量明顯升高,SOD和GSH-Px活性降低?；钚匝踝杂苫趔w內(nèi)脂肪酸導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA積累,而MDA含量是氧化損傷程度的重要標(biāo)志[16]。SOD和GSH-Px是體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì),其可對(duì)抗和阻斷活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害,及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞[17]。抑制lncRNA RMST表達(dá)后,SOD和GSH-Px活力升高,MDA含量降低,LDH釋放量降低,說(shuō)明抑制lncRNA RMST表達(dá)可提高HCM細(xì)胞抗氧化能力,減輕H/R誘導(dǎo)的HCM細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡。

多項(xiàng)研究證實(shí),lncRNA通過(guò)發(fā)揮miRNA分子海綿作用,進(jìn)而參與心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷[18-19]。例如,lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,NEAT1)通過(guò)抑制miR-520a表達(dá)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá),改變Caspase-3活化水平進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞免于H/R誘導(dǎo)的凋亡[20]。丹參酮ⅡA能夠減輕H/R處理后心肌細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激和線粒體膜電位改變,其機(jī)制與下調(diào)lncRNA AK003290/miR-124-5p分子軸有關(guān)[21]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)lncRNA RMST對(duì)miR-224-3p具有靶向負(fù)調(diào)控作用。miR-224-3p位于染色體Xq28,研究顯示過(guò)表達(dá)miR-224-3p可降低骨肉瘤細(xì)胞活力和侵襲能力,具有抗腫瘤作用[22]。過(guò)表達(dá)miR-224-3p還可降低高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果顯示,H/R誘導(dǎo)可降低HCM細(xì)胞中miR-224-3p表達(dá)水平,過(guò)表達(dá)miR-224-3p可提高HCM細(xì)胞存活和抗氧化應(yīng)激能力,減輕H/R誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激損傷。此外,本研究證實(shí),miR-224-3p是lncRNA RMST的直接靶點(diǎn),且lncRNA RMST對(duì)miR-224-3p具有負(fù)調(diào)控作用。由于抑制lncRNA RMST表達(dá)與過(guò)表達(dá)miR-224-3p的抗凋亡、抗氧化應(yīng)激損傷作用類似,本研究推測(cè)HCM細(xì)胞中存在lncRNA RMST/miR-224-3p通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-224-3p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA RMST對(duì)H/R處理的HCM細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷的影響,這進(jìn)一步說(shuō)明抑制lncRNA RMST通過(guò)靶向miR-224-3p對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述,H/R誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA RMST表達(dá)升高、miR-224-3p表達(dá)降低。抑制lncRNA RMST通過(guò)靶向上調(diào)miR-224-3p能夠減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷,為心肌I/R損傷治療提供了新的方向。