黃 慧,林 敏,曾桂香

肝豆狀核變性,又稱為威爾森病(Wilson’s disease,WD),是一種與ATP7B基因突變相關的常染色體隱性銅代謝疾病。ATP7B基因編碼跨膜P型ATPase銅轉運蛋白(transmembrane P-type ATPase copper transporter,ATP7B)[1]。目前,已經發(fā)現有700多種致病的ATP7B變異類型[2]。ATP7B在肝細胞銅蓄積過程中起重要作用[3]。在WD患者,ATP7B基因功能受損會導致銅在人體內異常積累,肝臟受影響最大,其次是腦等其他器官。銅代謝異常主要通過氧化應激和破壞蛋白質結構等誘導細胞凋亡,從而產生細胞毒性[4]。銅會促進活性氧的生成,引起線粒體膜和其他細胞內膜結構的脂質過氧化。此外,過量的銅也會導致細胞內脂質代謝異常。WD的臨床表現多種多樣,包括肝臟、神經和精神癥狀等。兒科患者以肝臟癥狀為主起病[5]。輕癥的WD可僅有無癥狀的血清轉氨酶升高,而重癥甚至可導致急性肝功能衰竭。在臨床診療過程中,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)和自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)也較常見,需要與WD相鑒別。目前,兒童肥胖和NAFLD發(fā)病率正在迅速上升。NAFLD已成為美國慢性肝病的最常見的病因[6]。本研究旨在探討兒童WD、NAFLD和AIH患者肝組織超微結構特征變化,現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2018年12月～2022年2月我院診治的WD患兒37例,男性20例,女性17例,年齡為8.5～14.0歲,平均年齡為(11.0±2.1)歲;NAFLD患兒20例,男性9例,女性11例,年齡為9.0～12.5歲,平均年齡為(11.0±0.9)歲;AIH患兒17例,男性3例,女性14例,年齡為5.5～14.5歲,平均年齡為(10.0±3.2)歲。WD的診斷符合《中國肝豆狀核變性診治指南》(2021年):存在肝損傷和椎體外系受損表現,角膜K-F環(huán)陽性,血清銅藍蛋白水平下降,24 h尿銅升高,影像學檢查表現符合WD;NAFLD的診斷符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》的標準,超聲檢查至少符合以下兩項:肝臟近場回聲彌漫性增強(“明亮肝”),且回聲強于腎臟,肝臟遠場回聲逐漸衰減,肝內管道結構顯示不清;AIH的診斷符合1998年國際自身免疫性肝炎小組修訂的《自身免疫性肝炎描述性診斷標準及評分診斷標準》,即AIH診斷評分大于或等于12分,血清IgG、IgM和IgA水平異常升高,肝組織出現淋巴細胞、漿細胞浸潤和玫瑰花環(huán)樣結構,無HBV或HCV感染證據。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 肝活檢 使用美國Bard公司提供的MG-1522型全自動活檢槍,在超聲引導下穿刺獲取肝組織,長度約為1.5～2.0 cm。一部分肝組織經4% 甲醛溶液固定、 75%～100%乙醇梯度脫水,石蠟包埋后,4μm連續(xù)切片,行常規(guī)HE染色,在日本Olympus公司提供的BX53型光學顯微鏡下觀察。將另一部分肝組織置于4℃,經2.5%戊二醛固定,再4℃、1%鋨酸固定,經乙醇和丙酮脫水,用環(huán)氧樹脂包埋,制成1μm厚的半薄片,使用鉆石刀切制成70 nm厚的超薄切片,經鈾鉛染色,使用日本JEOL公司提供的JEM-1200EX型透射電鏡觀察。

2 結果

2.1 三組肝組織學表現比較 WD組纖維化和銅染色陽性占比顯著高于NAFLD組,而巨泡狀脂肪變性和小脂滴比例顯著低于NAFLD組;WD組肝組織巨泡狀脂肪變性、小脂滴和肝細胞核空泡樣變比例顯著高于AIH組,而門脈炎癥、界面性肝炎、小葉內炎癥、漿細胞浸潤(>30%)和肝細胞玫瑰花樣結構比例顯著低于AIH組,差異具有統計學意義(P<0.05,表1)。

表1 三組肝組織學表現(%)比較

2.2 三組肝組織超微結構特征比較 WD組線粒體多形性、嵴尖端擴張、膜復制和基質密度增高比例顯著高于NAFLD組或AIH組,而夾雜準晶體比例顯著低于NAFLD組(P<0.05,表2)。

表2 三組肝組織超微結構表現特征(%)比較

3 討論

在本研究,我們評估了兒童WD患者肝組織超微結構特征,并與年齡相匹配的NAFLD和AIH患兒進行了比較。這三種臨床上重要的肝病有重疊的臨床表現,但它們治療方法有所不同[7]。在基層醫(yī)療單位,由于WD病例不常見,診治經驗少,診斷兒童WD具有很大的挑戰(zhàn)性。研究兒童肝病患者肝組織學表現特征對于理解臨床表現可能有幫助。我們的研究表明,大多數兒童WD患者在超微結構上都有線粒體形態(tài)結構的改變,包括線粒體嵴尖端擴張、多形性、膜復制和基質密度增高。本研究在光鏡下觀察肝組織學特征表明,這三種疾病之間存在廣泛的病理學表現重疊。通常,兒童WD在組織學上表現也有脂肪變性或脂肪性肝炎,是其與NAFLD的鑒別診斷帶來了挑戰(zhàn)。因此,熟悉各種疾病的臨床特點,并結合組織病理學特征區(qū)分WD與NAFLD的必要性[8]。幾乎所有的NAFLD病例都有巨泡狀脂肪變性,而相比之下,只有3例WD患者發(fā)現局灶性微泡狀脂肪變性。之前也有研究證明了這個發(fā)現,即微泡狀脂肪變性在WD患者并不是典型的特征[9],但偶爾可能與巨泡狀脂肪變性同時存在。在大多數WD和AIH病例都觀察到了一定程度的肝纖維化,表明肝纖維化僅僅是疾病進展的一個特征,而不是區(qū)分WD與AIH的有效指標。由于兒童NAFLD以脂肪變?yōu)橹?肝組織炎癥和纖維化還相對少見。此外,根據經驗,銅染色不能用于診斷或排除WD[10]。在本研究,只有29.7%WD和23.5%AIH患者肝組織銅染色陽性。本組WD和AIH患兒還存在肝纖維化表現。如果不加以干預,可能會導致肝功能進一步損傷和肝硬化。眾所周知,在WD的早期階段,肝細胞中銅還沒有大量積聚在溶酶體中,因此還不能被現有的組織化學染色技術所識別。

WD患者肝組織線粒體功能的異常與銅超載有直接的關系。銅的排泄障礙會導致銅的異常蓄積,從而導致大量自由基生產和嚴重的氧化應激,進而對肝細胞造成損傷[11]。線粒體對氧化應激非常敏感。已有研究表明,相比于光鏡下觀察到的組織學改變,在超微結構上線粒體的改變可以更早被觀察到。有研究發(fā)現,小鼠肝細胞線粒體結構的早期典型改變比其他組織學改變出現的時間更早[12]。在WD患者肝組織,電子傳遞鏈上復合體IV(細胞色素C氧化酶)減少是早期線粒體損傷的顯著特征[13]。心磷脂對線粒體膜的完整性和維持起著至關重要的作用,影響線粒體膜的通透性[14]。心磷脂的氧化損傷會導致線粒體大小和形狀的變化(即多形性),線粒體基質密度增高,從而導致膜復制和嵴尖擴張[15]。從受損的線粒體中釋放的細胞色素C會激活細胞凋亡途徑,下調膽固醇的生物合成,從而導致脂肪變性。在患有肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎或明顯的AIH兒童,有效地識別WD十分關鍵[16]。本研究表明,對肝細胞超微結構的觀察評估可以有助于在這類患者中識別WD。

我們認識到,目前使用電子顯微鏡觀察診斷還不能普及,部分原因是所需的設備比較昂貴,要求的技能比較苛刻[17]。通過測量肝臟活檢樣本中銅濃度或檢測ATP7B基因,在一定程度上可以有效地診斷WD,但是在兒科實踐中,這些方法可能并沒有那么容易做到[18]。如果肝組織取樣不足,則無法有效檢測肝組織實質中的銅濃度,而兒童肝臟活檢所獲得的樣本量往往少于檢測銅濃度所需的組織樣本量[19]。同樣,通過基因分型來診斷WD也有一定的障礙[20]。因此,肝組織超微結構檢查提供的信息對于兒童WD的診斷可能非常關鍵。

綜上所述,光鏡下觀察WD、NAFLD和AIH兒童肝組織病變有相當大的重疊,而肝組織超微結構表現對鑒別WD與NAFLD和AIH非常重要,在兒科工作實踐中,在可能的情況下可以考慮開展肝臟超微結構檢查,以幫助評估診斷和病情變化。一般認為,由于NAFLD兒童有明顯的臨床特征變化,如肥胖、超重、血清酶學升高和常規(guī)影像學檢查的變化,診斷不難。WD不常見,診斷需要高技術手段,治療時間長,管理較困難,因此需要特別關注。兒童AIH發(fā)病相對更低,早期表現更隱匿,診斷需要臨床醫(yī)生想到并進行必要的血清抗體檢測。肝組織學檢查也有助于評估病情嚴重程度和治療應答,都需要認真開展和隨訪。