張丹眉,石春霞,陳 倩,張璐懿,張清奇,鄒旭晨,龔作炯

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是一種致死率高、缺乏有效的治療措施、預(yù)后差的嚴(yán)重臨床綜合征,常伴有高膽紅素血癥、凝血功能障礙和肝性腦病。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)聯(lián)合D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal)誘導(dǎo)的ALF模型與人類肝功能衰竭相近,被廣泛用于探索肝功能衰竭的發(fā)生機(jī)制和治療藥物研究[1]。過度的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞自噬失調(diào)是ALF發(fā)生的重要致病機(jī)制。肝臟損傷激活炎癥機(jī)制,促進(jìn)細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等釋放,進(jìn)一步加重肝臟損傷,導(dǎo)致肝功能障礙[2]。自噬在ALF的發(fā)病過程中起著基礎(chǔ)性預(yù)防功能,激活自噬可以抑制促炎因子的產(chǎn)生,改善肝損傷[3]。多種細(xì)胞廣泛表達(dá)糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β),后者在靜息時(shí)處于活性狀態(tài),而其第9位絲氨酸被磷酸化后其活性被抑制,參與細(xì)胞增殖和分化等各種生理活動(dòng)[4]。多種研究顯示,活化的GSK3β能夠激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB),提高轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活性,從而促進(jìn)炎癥因子的合成和釋放[5],促進(jìn)炎癥反應(yīng)。此外,GSK3β可以通過多種通路抑制自噬通量,促進(jìn)疾病進(jìn)展[6]。目前,有研究應(yīng)用GSK3β抑制劑TDZD-8通過激活自噬,減輕腎臟缺血再灌注損傷,同時(shí)可以降低NF-κB的活性[7]。抑制GSK3β活性也可減輕PM2.5誘導(dǎo)的支氣管炎癥,緩解癥狀[8]。然而,針對(duì)TDZD-8對(duì)ALF影響及其作用機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)采用LPS聯(lián)合D-Gal誘導(dǎo)ALF小鼠模型,觀察到TDZD-8的保護(hù)作用,并采用蛋白印跡(Western blot,WB)等方法檢測(cè)炎癥因子和自噬相關(guān)蛋白表達(dá),探索了可能的保護(hù)機(jī)制,為防治ALF進(jìn)行了新的探索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物與試劑 24只8周齡雄性無特定病原體級(jí)C57BL/6小鼠(購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司),體質(zhì)量約為20～25 g; D-Gal和LPS購自美國Sigma-Aldrich公司; TDZD-8購自美國MCE公司;定量熒光檢測(cè)游離雙鏈DNA(cell free-DNA,cf-DNA)試劑盒購自美國賽默飛公司;檢測(cè)小鼠TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒和檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)的生化試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;抗IL-1β抗體、抗Beclin抗體購自英國Abcam公司;抗IL-18、抗ULK1、抗P62和抗GAPDH抗體購自武漢三鷹公司。

1.2 ALF動(dòng)物模型的制備 取24只小鼠,隨機(jī)分為三組,每組8只。TDZD-8處理組:給予小鼠TDZD-8 2 mg. kg-1腹腔注射,預(yù)處理。2 h后,給予D-Gal 400 mg.kg-1和LPS 100 μg.kg-1腹腔注射,制備ALF模型;模型組:先給予小鼠等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射,2 h后腹腔注射相同劑量的D-Gal和LPS,制備ALF模型;對(duì)照組:于兩個(gè)階段分別給予小鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。造模后24 h處死小鼠,收集血清和肝組織,-80℃凍存。取肝組織0.3 cm × 0.4 cm,于4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋,切片、HE染色,光鏡下觀察。

1.3 肝組織勻漿細(xì)胞因子檢測(cè) 取肝組織,勻漿,5000 r/m離心15 min,取上清,采用ELISA法測(cè)定TNF-α和IL-1β水平。

1.4 血生化及cf-DNA測(cè)定 常規(guī)檢測(cè)血生化指標(biāo);采用熒光染料法檢測(cè)血清cf-DNA含量。

1.5 肝組織UNC-51樣激酶1 ( UNC-51-like kinase 1, ULK1)、Beclin1、P62、IL-1β和IL-18蛋白檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法檢測(cè),將收集的組織取黃豆大小稱量,按照1 g組織15 ml裂解液的比例加入蛋白裂解液,提取組織蛋白質(zhì)。用BCA法測(cè)定蛋白含量,以每孔30 μg蛋白含量調(diào)整蛋白濃度,加入上樣緩沖液后100℃煮沸10 min,每孔等量上樣,電泳后轉(zhuǎn)膜,室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗4℃搖床孵育過夜。而后TBST洗膜,室溫孵育熒光二抗1 h,用TBST洗膜,使用Odyssey儀器掃描,分析計(jì)算各指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝組織病理學(xué)改變 對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞無明顯變性、壞死或炎癥細(xì)胞浸潤;模型組和TDZD-8組有不同程度的肝損傷表現(xiàn),模型組損傷更為嚴(yán)重,可見明顯的小葉內(nèi)充血、肝組織結(jié)構(gòu)紊亂和肝細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤;TDZD-8處理組小鼠肝組織仍有少量的損傷表現(xiàn),但其程度明顯較模型組改善(圖1)。

圖1 小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE, 200×)A:對(duì)照組;B:模型組;C:TDZD-8處理組

2.2 各組小鼠血生化指標(biāo)比較 模型組血清ALT、AST和TBIL水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而TDZD-8處理組小鼠血清肝功能指標(biāo)較模型組均有顯著的降低(P<0.05,表1)。

表1 各組小鼠血生化指標(biāo)比較

2.3 各組血清和肝組織勻漿炎癥指標(biāo)變化比較 模型組小鼠血清cf-DNA以及肝勻漿TNF-α和IL-1β水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而經(jīng)TDZD-8處理后,這些指標(biāo)水平均較模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 各組血清和肝組織勻漿炎癥指標(biāo)比較

2.4 三組肝組織細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)量比較 模型組IL-18和IL-1β相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(#P<0.05),而TDZD-8處理組小鼠蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著減弱(*P<0.05,圖2A、2B)。

圖2 三組肝組織細(xì)胞因子表達(dá)情況 與對(duì)照組比,#P<0.05;與模型組比,*P<0.05

2.5 三組肝組織ULK1、Beclin1和P62相對(duì)表達(dá)量比較 模型組肝組織ULK1和Beclin1相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(*P<0.05),而P62蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(#P<0.05),經(jīng)TDZD-8處理,肝組織ULK1和Beclin1相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組,而P62蛋白表現(xiàn)顯著降低(*P<0.05,圖3)。

圖3 各組肝組織ULK1、Beclin1和P62相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比,#P<0.05;與模型組比,*P<0.05

3 討論

作為GSK3兩種亞型之一的GSK3β,是在哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在細(xì)胞靜息時(shí),其處于活性狀態(tài),能磷酸化多種底物,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理過程。同時(shí),與腫瘤、炎癥等疾病密切相關(guān)[9],能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路[5]、與AMPK相互作用[10]等通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡、加重炎癥反應(yīng)、抑制自噬產(chǎn)生等加重疾病進(jìn)展。非ATP競(jìng)爭(zhēng)性GSK3β抑制劑,TDZD-8被顯示有損傷保護(hù)、抗炎癥和抗氧化應(yīng)激等功能。TDZD-8通過磷酸化GSK3β第9位絲氨酸而抑制其活性,并通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等方式起到損傷保護(hù)作用。在大鼠慢性腎移植模型,TDZD-8能抑制GSK3β活性,通過抑制NF-κB激活和巨噬細(xì)胞浸潤等而改善腎功能、減少蛋白尿,減少腎損傷[11,12]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TDZD-8處理組小鼠肝組織充血、炎細(xì)胞浸潤和細(xì)胞骨架破壞都有所緩解,血清ALT、AST、TBIL水平有明顯的下降,提示GSK3β抑制劑TDZD-8具有一定的肝臟保護(hù)功能,能緩解肝損傷。

ALF的發(fā)生伴隨著炎癥反應(yīng)的過度激活。有研究顯示,NF-κB通路和NLRP3炎癥小體形成在ALF進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。NF-κB是激活產(chǎn)生各種促炎因子,如IL-1β的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,緩解ALF動(dòng)物肝損傷[13]。同樣地,NLRP3炎癥小體的激活能促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)的激活,切割炎癥因子IL-1β和IL-18的前體,生成具有活性的IL-1β和IL-18,促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡[14]。cf-DNA被認(rèn)為是損傷的組織和凋亡壞死細(xì)胞分泌的核酸片段,以低水平狀態(tài)存在于正常健康個(gè)體。在異常細(xì)胞死亡損傷的疾病時(shí),如癌癥、創(chuàng)傷、炎癥性疾病等,大量核酸從壞死細(xì)胞釋放到血流,以致cf-DNA水平顯著升高。cf-DNA已成為衰老、組織損傷和細(xì)胞應(yīng)激的有希望的生物標(biāo)志物。有研究顯示,血漿cf-DNA水平與非酒精性脂肪肝、乙型肝炎和肝細(xì)胞癌等多種肝病相關(guān),有望成為新型的非侵入性標(biāo)志物。在肝細(xì)胞癌,cf-DNA水平也與肝臟炎癥程度相關(guān),在一定程度上能夠反映肝臟的炎癥損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組無論是IL-1β和IL-18還是TNF-α和cf-DNA水平均較對(duì)照組升高。有研究顯示在狼瘡腎炎小鼠,應(yīng)用TDZD-8抑制GSK3β活性可以通過抑制NLRP3炎癥體的激活,下調(diào)IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生,而緩解腎損傷[16]。在本實(shí)驗(yàn),經(jīng)TDZD-8處理的小鼠炎癥因子水平均有所降低,可能是通過抑制GSK3β活性,繼而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和NKRP3炎癥小體的激活。GSK3β抑制劑可能是通過激活過氧化物酶體增殖激活受體(PPARα)而抑制NF-κB通路的。

自噬是一種溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)分解代謝的過程。在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下,如營養(yǎng)缺乏、缺氧等時(shí),自噬被激活,移除受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、防止細(xì)胞損傷和支持細(xì)胞生存[17]。同時(shí),自噬也可以分解老化的細(xì)胞器或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì),維持能量平衡。自噬過程包括自噬的誘導(dǎo)啟動(dòng)、自噬小體形成和自噬小體與溶酶體的融合。ULK1被認(rèn)為是啟動(dòng)自噬的主要成分之一。ULK1的激活能促進(jìn)自噬程序的啟動(dòng)[18]。轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)正向調(diào)解自噬和溶酶體基因的轉(zhuǎn)錄,其活性受GSK3β等分子的調(diào)節(jié)[19]。P62蛋白是目前廣泛研究的自噬相關(guān)底物。在細(xì)胞自噬誘導(dǎo)時(shí),P62蛋白在細(xì)胞中聚集。相反,自噬水平抑制時(shí),P62蛋白水平也會(huì)下降。AKT、AMPK和PPARα等信號(hào)分子參與調(diào)解自噬程序的啟動(dòng),并與GSK3β之間相互影響,涉及多條信號(hào)通路。抑制GSK3β活性被認(rèn)為能夠通過多種方式促進(jìn)自噬產(chǎn)生和溶酶體酸化,參與損傷的保護(hù)過程。在乙型肝炎病毒引起的急性肝衰竭患者也觀察到自噬通量的下降[20]。正如本研究結(jié)果顯示,模型組自噬標(biāo)志蛋白ULK1和Beclin1水平均較對(duì)照組降低,但P62蛋白在模型組明顯升高,而經(jīng)GSK3β抑制劑處理后,自噬水平較對(duì)照組明顯升高,說明抑制GSK3β后可以逆轉(zhuǎn)ALF動(dòng)物自噬抑制狀態(tài),可能通過自噬通路減輕肝臟炎癥,改善肝臟損傷。同樣地,在腎缺血再灌注損傷動(dòng)物,應(yīng)用GSK3β抑制劑TDZD-8能夠通過激活自噬水平而上調(diào)水通道蛋白1表達(dá)[7],而起到緩解腎損傷的作用。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。