高天佐，孫娜娜，宋姍姍，趙成龍，張玉杰，段坦然，鄂偉，楊雪

（青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物基因國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266041）

1 病原學(xué)

1.1 分類及形態(tài)

禽腦脊髓炎病毒（AEV）屬于細(xì)小核糖核酸病毒科，腸道病毒屬，無囊膜，病毒粒子直徑為20～30nm，呈球形，該病毒只有一個(gè)血清型。

1.2 生物學(xué)特征

不同分離株屬于同一血清型，但可根據(jù)對(duì)組織的侵蝕性不同，分為嗜腸型和嗜神經(jīng)型，嗜腸型以自然野毒株為代表，通過口腔感染雞，并在糞便中傳播；嗜神經(jīng)型以胚適應(yīng)株為代表，口腔一般不引起發(fā)病，通過腦內(nèi)接種可引起嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。

2 流行病學(xué)

2.1 AEV 發(fā)病歷史回顧

1932 年美國(guó)首先報(bào)道此病，其后開始在非洲、亞洲、澳大利亞、歐洲以及北美和南美蔓延；近年來，在伊朗、日本、巴西、韓國(guó)、希臘等國(guó)家時(shí)有發(fā)病的報(bào)道。

在我國(guó)，1980 年曾有疑似發(fā)病的報(bào)道；1982 年通過病理組織學(xué)方法，作出了此病的診療報(bào)告；1983 年通過流行病學(xué)調(diào)查、病理組織學(xué)的研究和人工發(fā)病等試驗(yàn)，確診了此病，進(jìn)一步證實(shí)AEV在我國(guó)的存在。此后，廣西、江蘇、福建、上海、山東、內(nèi)蒙古、黑龍江、河北、河南、江西、湖北等全國(guó)大多數(shù)商業(yè)化養(yǎng)禽地區(qū)都有此病的報(bào)道[1]。

2.2 近年流行規(guī)律及發(fā)病特點(diǎn)

1）本病季節(jié)性不明顯，一年四季均可發(fā)生，雞、野雞、鵪鶉、火雞和鴿子均可感染本病，雞對(duì)本病最易感，產(chǎn)蛋雞主要表現(xiàn)一過性產(chǎn)蛋下降現(xiàn)象，本病既可垂直傳播，也可通過消化道等水平傳播，種雞產(chǎn)蛋期間感染后4 周內(nèi)所產(chǎn)的種蛋帶有病毒，少部分感染的胚蛋在孵化后期死亡，大部分感染的雞胚可以孵化出殼，但出殼的雛雞在出殼后陸續(xù)出現(xiàn)典型的發(fā)病癥狀，隨著種雞感染后期抗體的產(chǎn)生與穩(wěn)定，蛋傳現(xiàn)象隨之逐漸降低甚至消失[2]。

2）以往的認(rèn)知中，AEV 在育成階段可感染并不表現(xiàn)臨床癥狀，但近年國(guó)內(nèi)許多養(yǎng)殖場(chǎng)免疫多在用進(jìn)口AEV 活疫苗，1～4 周左右的雞群不斷出現(xiàn)消瘦、癱瘓和頭頸震顫、翅膀下垂等雞只，且可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月以上，發(fā)病率在1%～10%不等，大群正常，個(gè)別案例病程持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，有的甚至持續(xù)到開產(chǎn)后，給養(yǎng)殖企業(yè)造成巨大損失，也是近期AE 發(fā)病的主要原因。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)分析

截至目前統(tǒng)計(jì)該現(xiàn)象明顯呈上升趨勢(shì)，發(fā)病時(shí)間（圖1，圖2）沒有明顯規(guī)律性，發(fā)病群間（圖3）主要為蛋雞系列（蛋雞、蛋種雞）其次為肉種雞，北方地區(qū)蛋用型雞群飼養(yǎng)較多，發(fā)病也較為突出（圖4），發(fā)病日齡（圖5）多集中在90～120 日齡。

圖1 2021 年發(fā)病時(shí)間分布

圖2 1～8 月發(fā)病時(shí)間分布（2021-2022 年）

圖3 發(fā)病群間分布

圖4 發(fā)病空間分布

圖5 發(fā)病日齡分布

4 近年相關(guān)案例分享

4.1 案例

案例1：2020 年山東煙臺(tái)某蛋雞養(yǎng)殖公司，50 日齡免疫進(jìn)口A 公司AEV 活疫苗，70 日齡左右均出現(xiàn)不同程度癱瘓現(xiàn)象，主要表現(xiàn)側(cè)癱（如圖6，圖7），比例可高達(dá)10%左右，開產(chǎn)后未發(fā)現(xiàn)新增。

圖6 癱瘓、側(cè)癱

圖7 癱瘓、側(cè)癱

案例2：2021 年山東德州某90 日齡蛋種雞群免疫進(jìn)口B 公司AEV 活疫苗，兩周后出現(xiàn)癱瘓。同一個(gè)場(chǎng)3 個(gè)雞舍110 日齡時(shí)都發(fā)現(xiàn)明顯癱瘓，比例約在0.5%。

案例3：2022 年山西某肉種雞養(yǎng)殖公司，90 日齡免疫AEV 活疫苗，免后20 d 左右陸續(xù)出現(xiàn)癱雞（如圖8-圖10）

圖8 山西肉種雞側(cè)癱

圖9 山西肉種雞癱瘓

圖10 山西肉種雞癱瘓、側(cè)癱

案例4：2022 年吉林省某肉種雞養(yǎng)殖公司，2.4 萬套，51 日齡AEV活疫苗免疫，67 日齡常規(guī)免疫時(shí)發(fā)現(xiàn)癱瘓（如圖11，圖12）；6 棟雞舍，均出現(xiàn)，公雞少（肉種公雞飼養(yǎng)量多明顯低于母雞），母雞多，26 d 時(shí)間合計(jì)淘汰1.5%。

圖11 病雞癱瘓

圖12 病雞側(cè)癱

4.2 病原檢測(cè)

1）熒光PCR。通過熒光PCR 檢測(cè)，如圖13 中出現(xiàn)一條明顯的擴(kuò)增線為滑液囊支原體（MS）陽性對(duì)照，檢測(cè)樣本均未出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線。

圖13 熒光PCR 結(jié)果

2）RT-PCR/PCR 結(jié)果。送檢樣本通過RT-PCR/PCR 檢測(cè)到AEV 目的性基因條帶并送測(cè)序公司測(cè)序；均未檢測(cè)到病毒性關(guān)節(jié)炎與滑液囊支原體目的性基因條帶，圖14 為常規(guī)檢測(cè)樣本PTPCR/PCR 電泳結(jié)果，其中上數(shù)第2 排第6-10 樣本（圖15 為結(jié)果放大后圖片），檢測(cè)樣本分別為送檢樣本1、送檢樣本2、送檢樣本1、mark（2 000bp）、送檢樣本2，其中6、7 為短引物（285bp 擴(kuò)增性廣，國(guó)內(nèi)流行腦炎毒株外還可檢測(cè)日本腦炎），8、10 為AEV 長(zhǎng)引物（1 600bp 針對(duì)性強(qiáng)）。

圖14 常規(guī)檢測(cè)電泳圖

圖15 結(jié)果放大后圖片

3）測(cè)序結(jié)果。通過RT-PCR 檢測(cè)對(duì)送檢樣本進(jìn)行鑒定后送基因公司進(jìn)行測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AEV 活疫苗免疫后出現(xiàn)癱瘓、側(cè)癱情況多與疫苗關(guān)鍵位點(diǎn)突變有關(guān)，選擇部分發(fā)病群體使用的AEV 活疫苗進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)均在1408 位發(fā)生突變且存在毒力增強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，與這部分雞群病雞腦組織中分離的AEV 毒株在VP2、VP3 核苷酸序列上同源性分別為99.8%、99.7%，而且在與致病力相關(guān)核苷酸位點(diǎn)1408 位均發(fā)生突變。

4）細(xì)菌分離。未分離到細(xì)菌。

5 AEV 毒力相關(guān)位點(diǎn)研究

5.1 AEV 傳代過程中毒力的增強(qiáng)

參考國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)（表1），疫苗毒、野毒隨著傳代次數(shù)增加，19日齡胚體癱瘓比率增加、胚胎死亡率增加，相比對(duì)照組，19 日齡胚體平均重量下降明顯。

表1 傳代過程中毒力的增強(qiáng)

5.2 AEV 傳代過程中位點(diǎn)改變情況

通過整合測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分疫苗毒于第五代在1120 位出現(xiàn)A 到G 堿基變化；野毒株此位點(diǎn)未出現(xiàn)變化；部分疫苗株、野毒株并可于第五代在1408 位出現(xiàn)C 到T 堿基變化（表2）。

表2 測(cè)序結(jié)果比對(duì)

6 血清學(xué)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

隨著國(guó)內(nèi)雞群疫苗免疫意識(shí)越來越強(qiáng)、免疫廠家以及管理參差不齊的境況下，為了便于臨床診斷，試圖盡可能地通過Elisa（IDEXX）滴度值反映出雞群中野毒與疫苗毒之間的差距，近年對(duì)送檢樣本檢測(cè)中心收集并統(tǒng)計(jì)綜合數(shù)據(jù)（實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)與送檢情況相關(guān)，僅供參考），取平均值作為目前國(guó)內(nèi)雞群的參考值，雞群抗體滴度明顯高于參考值，建議結(jié)合場(chǎng)內(nèi)、雞群實(shí)際情況等綜合因素進(jìn)行分析，目前主要免疫品種為蛋（種）雞（圖16）、肉種雞（圖17）。

圖16 蛋（種）雞AE 參考值

圖17 肉種雞AE 參考值

7 討論

腦炎免疫后出現(xiàn)明顯癱瘓問題通過檢測(cè)顯示與毒株突變?cè)斐啥玖υ鰪?qiáng)有關(guān)，AEV 活疫苗的生產(chǎn)工藝具有較高的技術(shù)要求，建議選擇工藝成熟，質(zhì)量可靠的疫苗預(yù)防，并嚴(yán)格按照免疫劑量進(jìn)行免疫；在這里還要強(qiáng)調(diào)一下，也不是所有的癱瘓都是AEV 活疫苗毒力增強(qiáng)所致，臨床中要注意與滑液囊支原體、病毒性關(guān)節(jié)炎、飼料營(yíng)養(yǎng)吸收等疾病及管理因素做好區(qū)分；疫苗毒可以在腦部檢測(cè)到，屬于正?，F(xiàn)象，需要通過基因測(cè)序進(jìn)一步分析進(jìn)行區(qū)分。