鄭凱,袁仕國,歐陽怡佩,黃世穩(wěn)

(1 .右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,廣西 百色 533000;2. 海南省中醫(yī)院,海南 ?？?570203)

肝臟肝細胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)占原發(fā)性肝癌的70%～90%,是全球癌癥死亡的三大原因[1]。其發(fā)病機制尚不明確,臨床觀察顯示其為肝臟長期慢性肝病的終末期[2]。研究表明[3-4],肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制可能是肝癌診療與預后評估的瓶頸。LIHC嚴重威脅患者的健康,雖然手術治療已取得較好的成效,但預后效果仍很差[2]。因此,LIHC的治療仍為目前全世界面臨的難題。研究發(fā)現(xiàn)LIHC的相關基因對LIHC的早期診斷及預后十分重要。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)在機體大多數(shù)細胞中均可表達,廣泛參與機體生物學進程,是在胚胎發(fā)育、正常生長發(fā)育、免疫調控和維持機體平衡中起主導作用的多功能蛋白,控制著多種細胞類型的增殖、分化、凋亡和其他功能[5]。許多細胞合成TGFβ1,并有專門的受體,它積極或消極地調節(jié)許多其他生長因子[6]。TGFβ1在包括肝癌在內的肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮主導作用[7-8]。因此,了解TGFβ1及其信號通路在肝臟疾病中的具體作用機制,對肝臟疾病的進一步研究及治療具有重大臨床意義。近年來TGFβ1參與LIHC并指示其預后價值的研究報道少見,故本研究擬通過多個數(shù)據(jù)庫對TGFβ1基因進行數(shù)據(jù)挖掘,分析TGFβ1 在LIHC中的表達及其預后價值,為臨床診斷和治療提供有效的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究方法

1.1.1分析TGFβ1在正常組織和泛癌中的表達差異 利用數(shù)據(jù)庫TIMER 2.0的Cancer Explaoration 模塊中的Gene DE界面進行泛癌和正常組織中TGFβ1中的表達差異情況檢索,獲取在泛癌組織和正常組織中的表達情況的方框圖[9]。

1.1.2分析TGFβ1在LIHC中的差異表達 使用UALCAN數(shù)據(jù)庫中的TCGA模塊進行TCGA Gene分析TGFβ1在LIHC和正常組織中的表達差異情況。輸入TGFβ1基因名并在TCGA窗口選擇Liver hepatocellular carcinoma,選取Expression獲取TGFβ在正常組織和LIHC中的表達差異,并就患者年齡、性別、腫瘤分級、淋巴轉移情況、癌癥分期、T53突變狀態(tài)和組織學亞型分別分析TGFβ1在LIHC表達中的情況,分析TGFβ1 在不同臨床病理特征中的差異表達[10-12]。

1.1.3分析TGFβ1與LIHC預后的關系 利用數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter中mRNA系類組塊中的Liver cancer模塊,在Survival選項選取OS和RSF選項分析TGFβ1對LIHC患者總生存期的影響及無病生存期的影響,并繪制TGFβ1表達與生存關系KM的生存曲線[11-12]。

1.1.4構建TGFβ1蛋白互作網(wǎng)絡以及進行功能富集分析 在數(shù)據(jù)庫STRING中Protein Name輸入TGFβ1,Organism選擇Homosapiens進行檢索,具體參數(shù)設定為:置信度為0.7,首級及次級互動蛋白數(shù)量分別選擇不超過20和不超過10,繪制蛋白互作圖并篩選出與TGFβ1基因的密切相關的基因[13]。將上述與TGFβ1緊密的互作基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫,以FDR<0.05顯著性作為富集標注將進行GO功能富集和KEGG通路功能富集及分析[14]。

1.2統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析均采用數(shù)據(jù)庫默認的統(tǒng)計學分析方法進行:TGFβ1在泛癌組織和正常組織中的表達水平差異,采用Wilcoxon檢驗(TIMER 2.0);TGFβ1在LIHC與正常組織中的表達水平比較,采用單因素方差分析(UALCAN數(shù)據(jù)庫);TGFβ1高表達與生存率的比較,采用Logrank檢驗(TIMER 2.0)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TGFβ1在泛癌癥中的表達情況 結果顯示,TGFβ1在LIHC等多種癌癥組織中相較于正常組織都有較高的表達,見圖1。

注:與正常肝組織比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2TGFβ1在LIHC中的表達情況 TGFβ1在正常肝組織中的表達顯著低于LIHC組織(P<0.001)。見圖2。

2.3TGFβ1表達水平與患者臨床病理學特征的關系 在UALCAN數(shù)據(jù)庫中選擇性別、年齡、體重、腫瘤分期、淋巴轉移、個體癌癥分期、T53突變狀態(tài)及組織學亞型等方面進行相關性分析顯示,TGFβ1在上述不同臨床病理特征分期中存在差異表達。UALCAN結果顯示,TGFβ1表達水平與患者的上述臨床病理學特征有關,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

2.4TGFβ1對LIHC患者生存期的影響結果 TGFβ1的表達與LIHC患者的總體生存率有關(P<0.05),總體上減短患者的總生存期。而對患者無病生存期并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖4。

注:TGFβ1在LIHC組織中與正常肝組織比較,***P<0.001。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

注:A為總生存期,B為無病生存期。

2.5蛋白互作網(wǎng)絡與功能富集分析結果 結果發(fā)現(xiàn)30個蛋白與TGFβ1基因存在緊密互作關系(見圖5)。TGFβ1的互作蛋白被用于GO和KEGG功能富集分析(見圖6),其中KEGG富集的通路主要包括:癌癥相關通路(hsa05200)、癌癥中的蛋白聚糖(hsa05205)、TGFβ1信號通路(hsa04350)、轉化生長因子受體β信號通路(GO:0007179)、FoxO信號通路(hsa04068)、AGE-RAGE信號通路(hsa04933)、乙型肝炎(hsa05161)、人類t細胞白血病病毒1感染(hsa05166)等信號通路。GO富集的通路包括:2個分子功能、5個細胞組分和7個生物學過程,其中分子功能包括:蛋白結合(GO:0005515)和同源蛋白結合(GO:0042802)。細胞組分包括:胞核(GO:0005634)、細胞表面(GO:0000086)、質膜(GO:0005886)及細胞內外區(qū)域(GO:0005615,GO:0005576)。生物學過程包括:參與TGβ1受體信號道路(GO:007179)、細胞增殖的負性調控(GO:0008285)、老化(GO:0007568)、轉錄正調控及DNA模板化(GO:0045893)、傷口愈合(GO:0042060)、正向調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控(GO:0045944)、缺氧反應(GO:0001666)。

圖5 與TGFβ1基因存在緊密互作關系的蛋白

注:BP.生物學功能,CC.細胞組分,MF.分子功能,KEGG.信號通路。

3 討論

研究表明,LIHC的發(fā)生是多因素、多機制的調控過程。其中,肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化在肝纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用[15],對于慢性肝病的進程以及發(fā)展為肝硬化和LIHC等終末期肝病的進程的調節(jié)非常重要[16],而TGFβ1是活化HSC的重要蛋白因子,在急慢性肝損傷發(fā)生的早期,肝臟的固有細胞即肝細胞、庫普弗細胞(kupffe cell)及炎癥反應招募的免疫細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等分泌TGFβ1。TGFβ1參與HSC活化發(fā)生的多條細胞通路,引起早期肝纖維化的發(fā)生[17]。LIHC的晚期,TGFβ1在加速肝纖維化的發(fā)生、促進肝癌細胞的增殖、肝癌干細胞的擴增、血管的異常增生等方面發(fā)揮促進作用[18-19]。同時,TGFβ1可抑制免疫應答,為肝癌細胞的增長創(chuàng)造腫瘤微環(huán)境[20];TGFβ1還可以增強水解蛋白與細胞黏附分子結合的活性,為肝癌細胞的侵襲及轉移創(chuàng)造條件[21]?；谏鲜錾磉^程,TGFβ1對于LIHC的分子靶向治療具有重要的價值,由此,TGFβ1具有重要的研究價值。本研究結果顯示,TGFβ1在LIHC中的表達水平與正常組織相比較高。且高表達的TGFβ1與性別、年齡、體重、腫瘤分級、淋巴轉移情況、個體癌癥分期、組織學亞型及T53突變狀態(tài)等都有關。進一步分析發(fā)現(xiàn)Smad2、Smad3、TGFβR1和TGFβR2等為TGFβ1的緊密互作蛋白,經(jīng)功能富集分析,發(fā)現(xiàn)它們主要參與核酸轉錄調控、細胞增殖、老化、凋亡過程,是細胞核、質膜的組成成分,而且在癌癥相關通路、癌癥中的蛋白聚糖、TGFβ1信號通路、FoxO信號通路、AGE-RAGE等信號通路起作用。多種癌癥的發(fā)生都與TGFβ1信號通路有關,TGFβ1信號通路已被證明與肝細胞癌[22]、結直腸癌[23-24]、非小細胞肺癌[25]的發(fā)病機制有關,還參與了慢性腎癌的發(fā)生發(fā)展[26]。FoxO信號通路是主要的神經(jīng)活動信號通路,同時也是細胞癌變、癌癥發(fā)生發(fā)展的重要通路,其促進了前列腺癌的進展[27]。而且TGFβ1的相關基因MMP2被發(fā)現(xiàn)介導直腸癌淋巴轉移的發(fā)生[28],EP300被報道通過FBXW7-NOTCH-CCL2/CSF1軸改變腫瘤相關巨噬細胞極化,促進彌漫性大B細胞淋巴瘤的腫瘤進展[29]。由此可見,與TGFβ1緊密互作的這些蛋白大都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。

綜上所述,TGFβ1基因可能是導致LIHC患者預后不良的危險因素。另外,SMRF2和TIMP1等多個基因與TGFβ1緊密相關,本研究可為進一步探討LIHC發(fā)病機制以及預后價值提供一定的理論依據(jù)。