鄭少川,瞿申紅,張少杰,鐘自玲,張力行,程熹喬,莫麗萍,吳迪

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸科,廣西 南寧 530000;3. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院病理科,廣西 南寧 530000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是耳鼻咽喉科的常見(jiàn)疾病,影響全球10%～40%的人口,在世界范圍內(nèi)造成巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1-2]。AR的發(fā)病機(jī)制涉及Th1/Th2細(xì)胞失衡[3]、炎癥細(xì)胞的激活和IgE所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[4-5]。羧肽酶A3(carboxypeptidase A3,CPA3)是一種含鋅蛋白水解酶,由肥大細(xì)胞合成并存儲(chǔ)于分泌顆粒中,并隨肥大細(xì)胞脫顆粒而釋放至鼻腔黏膜[7]。多項(xiàng)研究支持CPA3參與了變應(yīng)性氣道疾病的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。呼吸上皮能為機(jī)體提供物理、功能和免疫屏障,使得機(jī)體免受外界有害物質(zhì)的傷害,緊密連接(tight junction,TJ)是消化道及呼吸道黏膜上皮的強(qiáng)細(xì)胞間連接[10],黏膜緊密連接的破壞是變應(yīng)性疾病發(fā)生與發(fā)展的重要原因[11-12]。在本研究中,我們構(gòu)建了卵清蛋白(ovalbumin,OVA)誘導(dǎo)的小鼠AR模型,通過(guò)常規(guī)病理、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR ,RT-qPCR) 等技術(shù)來(lái)評(píng)估小鼠鼻黏膜炎癥程度及緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,并初步探究其與CPA3之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雌性Balb/c小鼠28只,體重約為13～17 g ,購(gòu)買于廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,并飼養(yǎng)在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑 見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑

1.3模型建立 將小鼠隨機(jī)分成Control組和AR組,基礎(chǔ)致敏階段:AR組小鼠于第1天、第8天、第15天腹腔注射25 μL OVA(1%)和25 μL氫氧化鋁混合液,激發(fā)階段:在第22天～第28天使用1% OVA 進(jìn)行滴鼻激發(fā),1次/日,每側(cè)鼻孔15 μL ,Control組用等量的PBS替換OVA進(jìn)行基礎(chǔ)致敏和激發(fā)。在最后一次滴鼻激發(fā)24 h后處死小鼠,收集小鼠血清和鼻黏膜組織待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4行為學(xué)觀察 最后1次經(jīng)鼻PBS或OVA激發(fā)后,使用盲法由兩名觀察者記錄小鼠的抓鼻及打噴嚏的次數(shù),每只小鼠觀察15 min。

1.5RT-qPCR檢測(cè) 體式顯微鏡下剝離小鼠鼻黏膜,運(yùn)用傳統(tǒng)Trizol法提取鼻黏膜總RNA,使用MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄,使用2X SG Fast qPCR預(yù)混液(低Rox)進(jìn)行基因擴(kuò)增。相關(guān)引物序列,見(jiàn)表2。

表2 相關(guān)引物序列

1.6組織病理學(xué) 取小鼠鼻部,仔細(xì)剔除鼻骨周圍軟組織,隨后經(jīng)過(guò)脫鈣、固定、常規(guī)包埋和切片后,再進(jìn)行PAS、HE、IHC及甲苯胺藍(lán)染色。

2 結(jié)果

2.1小鼠行為觀察 為了確定鼻腔癥狀的變化,觀察了最后一次滴鼻激發(fā)后小鼠的打噴嚏和抓鼻頻率,發(fā)現(xiàn)AR小鼠表現(xiàn)出明顯的打噴嚏和抓鼻頻率,與Control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖1。

注:A.打噴嚏次數(shù);B.抓鼻次數(shù)。***P<0.001。

2.2OVA的經(jīng)鼻激發(fā)誘導(dǎo)了鼻腔嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞增生 完整的纖毛有助于鼻腔分泌物的正常排出,與Control組相比,AR組小鼠鼻黏膜纖毛排列紊亂,部分黏膜出現(xiàn)纖毛缺失。通過(guò)ImageJ對(duì)鼻黏膜HE染色和PAS染色進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示AR組小鼠鼻黏膜出現(xiàn)了明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖2A),杯狀細(xì)胞顯著增生、肥大(見(jiàn)圖2B),其中杯狀細(xì)胞主要在中鼻甲和鼻中隔中下部的黏膜表層,而嗜酸性粒細(xì)胞則彌散浸潤(rùn)在鼻黏膜的固有層。

注:A.Control組和AR組的HE染色,箭頭所示為嗜酸性粒細(xì)胞;B.Control組和AR組的PAS染色,箭頭所示為杯狀細(xì)胞;C.每個(gè)隨機(jī)視野嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù);D.每個(gè)隨機(jī)視野杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)。***P<0.001。

2.3小鼠鼻黏膜中Claudin-1、Claudin-4、JAM-A及ZO-1的表達(dá) 為了評(píng)估OVA誘導(dǎo)的鼻腔炎癥對(duì)鼻黏膜緊密連接及其相關(guān)蛋白的影響,評(píng)估了Claudin-1、Claudin-4、JAM-A及ZO-1的表達(dá)變化,與Control組相比,AR組鼻黏膜Claudin-1、Claudin-4 基因表達(dá)水平顯著下降(見(jiàn)圖3A、圖3B),且JAM-A的蛋白表達(dá)水平顯著低于Control組(見(jiàn)圖3C、圖3E),但并未觀察到ZO-1蛋白表達(dá)的顯著改變(見(jiàn)圖3D、圖3F)。

注: A和B分別為小鼠鼻黏膜Claudin-1、Claudin-4 相對(duì)基因表達(dá);C和D分別為JAM-A和ZO-1的免疫組織化學(xué)染色(原始放大倍數(shù)400×);E和F分別為JAM-A和ZO-1的平均光密度值定量。 ***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05,ns :無(wú)意義。

2.4小鼠鼻黏膜肥大細(xì)胞浸潤(rùn)及CPA3表達(dá)的變化 為了評(píng)估肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)情況,使用甲苯胺藍(lán)對(duì)鼻黏膜組織切片進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)AR組鼻腔黏膜固有層大量的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖4A),肥大細(xì)胞的數(shù)量明顯大于Control組(見(jiàn)圖4B),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)鼻黏膜組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)AR組CPA3 mRNA表達(dá)顯著高于Control組(見(jiàn)圖4C)。

注:A.小鼠鼻黏膜甲苯胺藍(lán)染色,箭頭所示為肥大細(xì)胞(原始放大倍數(shù)400×);B.每個(gè)隨機(jī)視野肥大細(xì)胞計(jì)數(shù);C.鼻黏膜CPA3的相對(duì)表達(dá)量。***P<0.001,**P<0.01

3 討論

AR是一種常見(jiàn)的鼻黏膜過(guò)敏性疾病,癥狀包括鼻癢、鼻塞、流清涕和打噴嚏[13],影響到全球10%～40%的人口,而且通常會(huì)持續(xù)一生,嚴(yán)重影響患者的學(xué)習(xí)、工作和生活[14]。AR的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,研究表明Th1/Th2細(xì)胞失衡[13]、多種炎癥細(xì)胞的活化和IgE所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)均參與其中[4-5]。羧肽酶A3是一種含鋅蛋白水解酶,由肥大細(xì)胞合成并存儲(chǔ)于分泌顆粒中,并隨肥大細(xì)胞脫顆粒而釋放至鼻腔黏膜[7],多項(xiàng)研究支持CPA3參與了變應(yīng)性氣道疾病的發(fā)生與發(fā)展[8-9],但具體機(jī)制尚未明確。有研究表明具有蛋白酶活性的日本雪松導(dǎo)致了鼻黏膜上皮屏障的破壞,并證明了重組蛋白酶抑制劑rhCystatin SN可以逆轉(zhuǎn)上皮屏障的損傷[15],因此CPA3的鼻黏膜釋放可能是上皮屏障損傷的重要原因之一。呼吸上皮提供物理、功能和免疫屏障,保護(hù)機(jī)體免受吸入環(huán)境顆粒的潛在傷害[10],當(dāng)上皮屏障受到損害時(shí),可能會(huì)激活針對(duì)外源性過(guò)敏原、微生物和污染物的免疫炎癥反應(yīng),反復(fù)的外源性刺激導(dǎo)致了鼻黏膜的慢性炎癥,而黏膜下炎癥本身將繼續(xù)維持上皮屏障的受損和開(kāi)放狀態(tài),使得機(jī)體持續(xù)受到過(guò)敏原、污染物、微生物及其酶和毒素等的持續(xù)傷害,導(dǎo)致惡性循環(huán)[16]。TJ是消化道及呼吸道黏膜上皮的強(qiáng)細(xì)胞間連接,是細(xì)胞旁通透性的關(guān)鍵調(diào)控因子,在對(duì)吸入的病原體產(chǎn)生限速屏障方面至關(guān)重要[10]。TJ包括跨膜蛋白和胞內(nèi)蛋白,TJ跨膜蛋白主要包括Claudins、Occludin、junctional adhesion molecules (JAMs),負(fù)責(zé)在細(xì)胞間隙建立強(qiáng)連接。TJ細(xì)胞質(zhì)蛋白主要包括ZO-1、ZO-2、ZO-3、MUPP-1、PAR-3、PAR-6等,主要作用是作為與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接的媒介[17]。本研究成功建立了OVA誘導(dǎo)的典型AR小鼠模型,模型組小鼠具有明顯的打噴嚏及抓鼻子等AR癥狀。有研究表明Th2型細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致杯狀細(xì)胞的增生和黏液分泌的增加[15],通過(guò)對(duì)小鼠鼻黏膜進(jìn)行HE和PAS染色,發(fā)現(xiàn)AR小鼠鼻黏膜大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞增生。為了探究OVA誘導(dǎo)的鼻腔炎癥對(duì)鼻黏膜CPA3及TJ相關(guān)蛋白的影響,本研究觀察了Claudin-1、Claudin-4、JAM-A和ZO-1的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)AR組TJ跨膜蛋白Claudin-1、Claudin-4和JAM-A的表達(dá)下降,這證明了OVA誘導(dǎo)的鼻腔炎癥導(dǎo)致了TJ的破壞。但本研究并未發(fā)現(xiàn)TJ胞內(nèi)蛋白Z0-1表達(dá)與Control組有顯著性差異,這可能提示導(dǎo)致TJ破壞的因素來(lái)自上皮細(xì)胞外的鼻腔或黏膜固有層。本研究證實(shí)了AR小鼠鼻黏膜固有層肥大細(xì)胞數(shù)量的上升和CPA3 mRNA的高表達(dá),其與TJ的破壞同時(shí)出現(xiàn)在AR小鼠的鼻黏膜,因此推測(cè)CPA3可能通過(guò)鼻黏膜TJ的破壞參與AR的發(fā)病,這一點(diǎn)還需要更進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證。

總之,本研究成功建立了OVA誘導(dǎo)的AR小鼠模型,并證實(shí)了AR小鼠鼻黏膜上皮TJ的破壞和CPA3的高表達(dá),預(yù)測(cè)CPA3可能是鼻黏膜TJ損傷的重要原因。這需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。