雷 宇 秦銀燕 何成章 陸 華 陳貞伶

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣西南寧市 530021)

生物檢查方法是考察藥物制劑療效及安全性的一種重要方法?！吨腥A人民共和國藥典(2015年版)》[1]明確要求對藥品的微生物檢查方法需要進行適用性試驗,使檢查結(jié)果更具可比性,接近于國際標(biāo)準(zhǔn)。速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液是廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院自行生產(chǎn)的醫(yī)院制劑,多年的臨床應(yīng)用實踐表明這兩種藥物的安全性好,療效顯著。速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液的處方成分相同,主要成分包含硫酸慶大霉素、地塞米松磷酸鈉等。由于上述制劑本身具有很強的抑菌作用,建立適宜的生物學(xué)檢查方法以保證制劑的藥品質(zhì)量,具有重要意義。本研究參照《中華人民共和國藥典(2015年版)》[1]及相關(guān)文獻[2]的相關(guān)要求進行了系列實驗研究,初步探討速康寧滴眼液和速康寧滴鼻液的生物學(xué)檢查方法,現(xiàn)報告如下。

1 材 料

1.1 儀器 BSC-1600ⅡA2型生物潔凈安全柜、SW-CJ-ICU型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),LDZF-50L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),DHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、MJ-250-Ⅱ型霉菌恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),101-2AS型鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司),HTY-601型智能集菌儀、PY220型集菌培養(yǎng)器(杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 供試品 速康寧滴眼液(規(guī)格:10 mL/支;批號:20190722、20190723、20190724)、速康寧滴鼻液(規(guī)格:10 mL/支;批號:20190717、20190718、20190719)均由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

1.3 試驗用菌株 金黃色葡萄球菌[菌號:CMCC(B)26003;批號:E0009B;有效期至2021-01-28)]、銅綠假單胞菌 [菌號:CMCC(B)10104;批號:E0042B;有效期至2021-01-01)]、大腸埃希菌[菌號:CMCC(B)44102;批號:E0019B;有效期至2021-04-18)]、枯草芽孢桿菌[菌號:CMCC(B)63501;批號:E0020B;有效期至2021-04-18]、白色念珠菌[菌號:CMCC(F)98001;批號:E0047B;有效期至2021-07-22]、黑曲霉菌[菌號:CMCC(F)98003;批號:E0054B;有效期至2021-09-21]均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;生孢梭菌[菌號:CMCC(B)64941,批號:190726,有效期至2020-07-25]購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 培養(yǎng)基和試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號:180524)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號:180820)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:180719)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號:180731)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號:180621)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號:180801)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號:180412)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號:180327)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:190402)、無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH為7.0,批號:181213)均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH為7.0)、0.9%無菌氯化鈉溶液、含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液均為廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室自配。以上培養(yǎng)基均符合《中華人民共和國藥典(2015年版)》[1]中的適用性試驗相關(guān)規(guī)定,可用于無菌檢查和微生物限度檢查。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液的制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌懸液的制備:將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取上述培養(yǎng)物1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×105至1×107倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL的菌懸液。

2.1.2 生孢梭菌菌懸液的制備:將生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取上述培養(yǎng)物1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×105至1×107倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL的菌懸液。

2.1.3 白色念珠菌菌懸液的制備:將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基,在(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,取上述培養(yǎng)物1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×105至1×107倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL之間的菌懸液。

2.1.4 黑曲霉菌菌懸液的制備:將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基,在(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,取上述培養(yǎng)物加到3～5 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,用無菌玻璃棒或接種環(huán)輕輕將孢子洗脫,然后用管口帶有無菌薄紗布的吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),取上述孢子懸液1 mL加到9 mL含0.05%(體積比)聚山梨酯80的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,按10倍遞減稀釋1×10-2至1×10-5倍,制成菌落數(shù)在50～100 CFU/mL之間的菌懸液。

2.2 菌懸液計數(shù) 取2.1中的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的菌懸液1 mL分別注入90 mm的無菌平皿,再注入15～20 mL不超過45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿,迅速混勻,每種實驗菌平行制備2皿。在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取2.1中的生孢梭菌菌懸液1 mL注入含30 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的試管,平行制備2管,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取2.1中的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌菌懸液各1 mL注入含18 mL 45 ℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿,每種實驗菌平行制備2皿,在(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。菌落計數(shù)結(jié)果見表1。

表1 各實驗菌的菌落計數(shù)結(jié)果

2.3 速康寧滴眼液無菌檢查方法適用性試驗及結(jié)果

2.3.1 薄膜過濾法沖洗操作步驟:以0.9%無菌氯化鈉溶液和含0.1%(體積比)聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑。采用智能集菌儀和集菌培養(yǎng)器進行采樣,每膜最大載樣量為50 mL。根據(jù)《中華人民共和國藥典(2015年版)》[1]相關(guān)規(guī)定,以大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為實驗菌,各實驗菌逐一進行實驗。(1)第1次預(yù)實驗。以0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每次沖洗量為100 mL,每膜沖洗3次,共300 mL。按規(guī)定觀察至第5天時,供試品陽性組的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌管的溶液仍澄清,未見目標(biāo)菌株生長,表明用上述方法仍不能消除供試品對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的干擾,因此,篩選出金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌進行下一步實驗。(2)第2次預(yù)實驗。根據(jù)第1次預(yù)實驗結(jié)果篩選出金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌,操作同“第1次預(yù)實驗”,以0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗液,分別以400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次進行沖洗,每次每膜沖洗量為100 mL。每膜總沖洗量為400 mL時,按規(guī)定觀察至第5天,供試品陽性組仍未見2種敏感菌生長。每膜總沖洗量為500 mL時,供試品陽性組的金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)至第4天時,可見微弱生長,按規(guī)定觀察至第5天時可見供試品陽性組的金黃色葡萄球菌生長良好,但枯草芽孢桿菌管溶液仍澄清,仍未見目標(biāo)菌生長,因此,篩選出枯草芽孢桿菌作為敏感菌進行下一步實驗。(3)第3次預(yù)實驗。根據(jù)第2次預(yù)實驗結(jié)果進一步篩選出枯草芽孢桿菌作為敏感菌,以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,分別以300 mL、400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次進行沖洗,每次每膜沖洗量為100 mL。每膜總沖洗量為500 mL時,按規(guī)定觀察至第5天時,供試品陽性組試管渾濁,枯草芽孢桿菌生長良好。預(yù)實驗結(jié)果見表2。

2.3.2 預(yù)實驗分組:(1)供試品陽性組。取30支速康寧滴眼液作為供試品,使用兩套無菌集菌培養(yǎng)器吸取至濾筒內(nèi),每套培養(yǎng)器濾過15支速康寧滴眼液,按薄膜過濾法進行過濾。按2.3.1方法逐一進行預(yù)實驗,每次預(yù)實驗中的最后一次沖洗劑中加入1 mL 50～100 CFU/mL的實驗菌菌懸液,過濾結(jié)束后,在接種大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌的濾筒內(nèi)加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,將其置于(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的濾筒內(nèi)加入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,將其置于(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)時間均為5 d,每隔24 h觀察1次。(2)沖洗劑陽性組。取當(dāng)次實驗用的沖洗劑替代供試品,按“供試品陽性組”同法操作。(3)陽性組。取兩套無菌集菌培養(yǎng)器,不濾過供試品或沖洗劑。在其中一套無菌集菌培養(yǎng)器中直接加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 mL,分別接種1 mL 50～100 CFU/mL的大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液至濾筒內(nèi);另一套直接加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL,分別接種1 mL 50～100 CFU/mL的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液至濾筒內(nèi)。(4)供試品本底菌組。按“供試品陽性組”同法操作,但取當(dāng)次實驗用的沖洗劑替代菌懸液。(5)陰性組。操作同“供試品本底菌組”,但取當(dāng)次實驗用的沖洗劑替代供試品。

2.3.3 結(jié)果判斷:在培養(yǎng)時間內(nèi),供試品陽性組、陽性組、沖洗劑陽性組溶液均出現(xiàn)渾濁,且出現(xiàn)渾濁時間相近,供試品本底菌組、陰性組溶液均澄清,則說明實驗結(jié)果符合規(guī)定。若陰性組溶液渾濁且確認有菌生長,則認為實驗無效[1]。本實驗用6株規(guī)定實驗菌對供試品逐一進行加菌實驗,結(jié)果顯示,以0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,總沖洗量為300 mL時,以大腸埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為實驗菌的供試品陽性組、陽性組、沖洗劑陽性組的溶液均出現(xiàn)渾濁,供試品本底菌組、陰性組溶液均澄清,說明對以上實驗菌株的實驗結(jié)果符合規(guī)定,但金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的實驗結(jié)果不符合規(guī)定。因此,第2次預(yù)實驗以金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌,并將總沖洗量加到500 mL,結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌的實驗結(jié)果符合規(guī)定,而枯草芽孢桿菌的實驗結(jié)果仍不符合規(guī)定。第3次預(yù)實驗以枯草芽孢桿菌作為敏感菌,用含0.1%(體積比)聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每膜總沖洗量為500 mL時結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌的實驗結(jié)果符合規(guī)定,見表2。

表2 速康寧滴眼液薄膜過濾法預(yù)實驗結(jié)果

根據(jù)上述預(yù)實驗結(jié)果,我們對3個不同批次(20190722、20190723、20190724)的速康寧滴眼液供試品進行適用性驗證,其結(jié)果與預(yù)實驗結(jié)果完全一致,提示該方法重復(fù)性好,可作為速康寧滴眼液無菌檢查方法。

2.4 速康寧滴鼻液微生物限度檢查方法適用性試驗及結(jié)果

2.4.1 傾注平皿法預(yù)實驗(1 mL/皿):(1)供試液的制備。① 取供試品10 mL,加入無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至90 mL,制得①液(1 ∶10供試液);②?、僖?0 mL,加入無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80 mL,制得②液(1 ∶20供試液);③?、僖?0 mL,加入無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50 mL,制得③液(1 ∶50供試液)。(2)分組進行實驗。① 供試品陽性組。取7個實驗管,每管加入供試液9.9 mL。其中,5管分別加入0.1 mL(<104CFU/mL)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液,混勻,取1 mL混合液注入平皿(平行制備2皿),再向平皿中注入15～20 mL溫度不超過40 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固后倒置,放于(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。另2管分別加入0.1 mL(<104CFU/mL)的白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液,混勻,取1 mL混合液注入1個平皿,平行制備2皿,再向平皿中注入15～20 mL溫度不超過40 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固后倒置,放于(23±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。② 陽性組。取無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,其他步驟同“供試品陽性組”。③ 供試品本底菌組。取無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代菌懸液,其他步驟同“供試品陽性組”。④ 陰性組。取無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,其他步驟同“供試品本底菌組”。第1次預(yù)實驗中,分別取供試品原液、① 液作為供試液,以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5種實驗菌作為需氧菌總數(shù)計數(shù)的代表菌,以白色念珠菌、黑曲霉菌2種實驗菌作為霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)的代表菌,各實驗菌逐一進行微生物回收實驗。第2次預(yù)試驗中,分別?、谝骸ⅱ垡鹤鳛楣┰囈?根據(jù)第1次實驗結(jié)果篩選出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌作為敏感菌進一步行加菌回收實驗。(3)結(jié)果判斷[6]。各實驗菌菌數(shù)回收率均在50%～200%范圍內(nèi),提示所采用的方法適用于該制劑的實驗菌總數(shù)計數(shù)檢查。若陰性組有菌生長,則認為實驗無效。實驗菌菌數(shù)回收率=(供試品陽性組平均菌落數(shù)-供試品本底菌組平均菌落數(shù))/陽性組平均菌落數(shù)×100%。本研究結(jié)果提示,采用傾注平皿法(1 mL/皿),把供試品稀釋成1 ∶50的供試液對需氧菌總數(shù)項進行加菌回收實驗,3株敏感實驗菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)的菌數(shù)回收率均>50%,該方法可作為該制劑的需氧菌總數(shù)計數(shù)的檢查方法,但由于供試品的稀釋比例較大,本底菌同時也會被稀釋,存在不被檢出的風(fēng)險,不建議采用此方法檢測銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。另使用1 ∶10供試液進行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù),白色念珠菌、黑曲霉菌的菌數(shù)回收率均>50%,故該方法可作為霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)的檢查方法。見表3。

表3 速康寧滴鼻液傾注平皿法預(yù)實驗結(jié)果

2.4.2 薄膜過濾法預(yù)實驗:根據(jù)2.4.1實驗結(jié)果,采用傾注平皿法檢測方法時,存在需氧菌不被檢出的風(fēng)險,因此采用薄膜過濾法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)。用①液作為供試液,每膜過濾供試液10 mL,以篩選出來的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為敏感菌,以0.9%無菌氯化鈉溶液或含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,對各敏感菌逐一進行微生物回收實驗,其中每種沖洗劑均分別以400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次沖洗濾膜,每次100 mL。分組及操作步驟同速康寧滴眼液的薄膜過濾法。結(jié)果顯示,以0.9%無菌氯化鈉作為沖洗劑,每膜沖洗量加至500 mL時,銅綠假單胞菌回收率仍<50%。因此,改用含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每膜沖洗量加至500 mL時,結(jié)果顯示銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌數(shù)回收率均>50%,見表4。

表4 速康寧滴鼻液薄膜過濾法預(yù)實驗結(jié)果

2.4.3 速康寧滴鼻液微生物限度檢查方法適用性試驗及結(jié)果:為檢驗預(yù)實驗方法的可行性,本研究取3個批次的速康寧滴鼻液(20190717、20190718、20190719),采用薄膜過濾法,用含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,每膜沖洗總量為500 mL,以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為代表菌,對需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查方法進行適用性試驗;采用傾注平皿法(1 mL/皿),取1 ∶10供試液,以白色念珠菌、黑曲霉菌作為代表菌,對霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查方法進行適用性試驗。結(jié)果顯示各實驗菌回收率均在50%～200%,與預(yù)實驗結(jié)果一致,表明該檢查方法的重復(fù)性好,驗證方法可靠。見表5、表6。

表5 3個批次速康寧滴鼻液薄膜過濾法適用性試驗結(jié)果

表6 3個批次速康寧滴鼻液傾注平皿法適用性試驗結(jié)果

2.5 速康寧滴鼻液控制菌檢查方法適用性試驗及結(jié)果 根據(jù)《中華人民共和國藥典(2015年版)》[1]相關(guān)規(guī)定,鼻用制劑對控制菌的要求為每1 g、1 mL、10 cm2的供試品不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。速康寧滴鼻液的控制菌檢查方法主要用于在符合上述規(guī)定的條件下,檢查本供試品中是否存在大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。 因此,對速康寧滴鼻液的控制菌檢查方法進行適用性試驗,以達到去除供試品的抑菌成分對實驗菌干擾的目的,確認所選用的方法是否適用于速康寧滴鼻液的控制菌檢查。

2.5.1 金黃色葡萄球菌:(1)供試品陽性組。① 直接接種法。取2.4.1制備的①液(1 ∶10供試液)10 mL和菌落數(shù)為50～100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL,分別接種至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。② 薄膜過濾法。取2.4.1制備的①液(1 ∶10供試液)10 mL,以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,按2.3.1中有關(guān)薄膜過濾法的操作方法,分別以400 mL、500 mL作為總沖洗量,依次進行沖洗,每膜每次沖洗100 mL,過濾結(jié)束后,用無菌鑷子將濾膜取出,分別接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(2)陽性對照組。用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液,其余操作同供試品陽性組。(3)供試品本底菌組:用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌懸液,其余操作同供試品陽性組。(4)陰性組:用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液、菌懸液,其余操作同供試品陽性組。(5)選擇與分離培養(yǎng)。取上述各組的液體培養(yǎng)物,接種至含甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,再在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(6)結(jié)果判斷。在含甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,如果沒有符合金黃色葡萄球菌形態(tài)特征的菌落生長,則判定為未檢出,反之則判定為檢出。

2.5.2 銅綠假單胞菌:(1)分組。用銅綠假單胞菌替代2.5.1中的金黃色葡萄球菌,分組和操作同2.5.1。(2)選擇與分離培養(yǎng)。取各組的液體培養(yǎng)物,劃線于含溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上,再在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。(3)氧化酶試驗。將無菌的濾紙片放在平皿上,用無菌玻璃棒在上述平板蘸取生長的菌落涂于紙片上,再滴加2滴新配制的1%二鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液,若在30 s內(nèi)培養(yǎng)物變成粉紅色并且逐漸變紫紅色,則判定為氧化酶試驗陽性,反之則為陰性。(4)結(jié)果判斷。在含溴化十六烷基二甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上,如果沒有符合銅綠假單胞菌形態(tài)特征的菌落生長,則判定為未檢出,反之則判定為檢出。

2.5.3 大腸埃希菌:(1)分組。用大腸埃希菌替代2.5.1中的金黃色葡萄球菌,分組和操作同2.5.1。(2)選擇與分離培養(yǎng)。取各組的液體培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基,在(43±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取麥康凱液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物劃線于含麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板,在(33±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。(3)結(jié)果判斷。在含麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,如果沒有符合大腸埃希菌形態(tài)特征的菌落生長,則判定為未檢出,反之則判定為檢出。

2.5.4 速康寧滴鼻液控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果:第1次預(yù)實驗采用常規(guī)法(直接接種法),用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌作為實驗菌,按2.5.1、2.5.2、2.5.3進行操作,對各實驗菌逐一進行檢測。結(jié)果顯示,在接種至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,陽性組均檢出3種實驗菌株,陰性組均無菌生長,供試品陽性組均未檢出3種實驗菌。見表7。第2次預(yù)實驗采用薄膜過濾法,實驗分組及實驗菌同第1次預(yù)實驗,結(jié)果顯示,每膜總沖洗量為400 mL,供試品陽性組的3種實驗菌均仍未見檢出;每膜總沖洗量為500 mL,供試品陽性組均能檢出3種實驗菌株。另取3個批次(20190717、20190718、20190719)速康寧滴鼻液樣品按上述方法進行控制菌檢查方法適用性試驗,結(jié)果顯示,3個批次供試品陽性組均能檢出相應(yīng)的目標(biāo)菌,說明驗證方法可靠。

表7 速康寧滴鼻液控制菌檢查方法適用性試驗的預(yù)實驗結(jié)果

3 討 論

與2010年版的《中華人民共和國藥典》相比,2015年版的《中華人民共和國藥典》生物檢查法在檢查方法和指導(dǎo)原則上均有較大的修訂,變更內(nèi)容涵蓋所用培養(yǎng)基、實驗用菌、加菌方式及判定標(biāo)準(zhǔn)等[1-2]。因此,原有的生物檢查法已不能滿足新版藥典的檢驗要求。本研究根據(jù)新版藥典的要求,針對速康寧滴眼液和滴鼻液建立新的生物限度檢查方法。

根據(jù)《中華人民共和國藥典(2015年版)》規(guī)定,應(yīng)對眼用制劑進行無菌檢查,應(yīng)對鼻用制劑進行微生物限度檢查,且應(yīng)對上述檢查方法進行適用性試驗,以確認所采用的方法適用于該制劑。本研究先通過預(yù)實驗用1個批次的制劑(眼用制劑和鼻用制劑)篩選出敏感菌,以確定初步的實驗方案,從而提高工作效率,快速有效地建立適宜檢查方法[3-6]。我們在對含有硫酸慶大霉素抑菌成分的速康寧滴眼液進行薄膜過濾法預(yù)實驗時發(fā)現(xiàn),以0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑時,沖洗量增至500 mL,枯草芽孢桿菌的實驗結(jié)果仍未符合標(biāo)準(zhǔn),因此我們采用聚山梨酯80類非離子表面活性劑作為沖洗劑,一方面該沖洗劑不具有抑菌性,另一方面該沖洗劑不對微生物造成損傷,在薄膜過濾法中起到很好的作用,既可以增加樣品的溶解性,又可增加沖洗液的洗脫力度,而且對微生物也有保護作用,可有效消除供試品對實驗菌的抑菌活性[7]。本研究對3個批次(20190722、20190723、20190724)的速康寧滴眼液供試品進行適用性試驗,結(jié)果與預(yù)實驗結(jié)果一致,重復(fù)性好,可作為速康寧滴眼液無菌檢查方法,這提示采用薄膜過濾法可以對速康寧滴眼液進行無菌檢查。

我們對速康寧滴鼻液進行微生物限度檢查時,采用傾注平皿法及1 ∶10供試液進行預(yù)實驗,發(fā)現(xiàn)用于霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)的2株實驗菌在各陽性組中生長良好,實驗菌菌數(shù)回收率在50%～200%范圍內(nèi),因此可以選擇使用傾注平皿法對霉菌和酵母菌進行微生物限度檢查。雖然3株(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)需氧菌敏感菌在1 ∶50供試液中的實驗菌菌數(shù)回收率合格,但是不能排除由于稀釋比例過大導(dǎo)致供試品本底菌同時被稀釋而不被檢出的風(fēng)險,因此選擇使用薄膜過濾法對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌進行微生物限度檢查,并以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑,均得到較好的實驗菌菌數(shù)回收率。因此,筆者建議,對類似硫酸慶大霉素等抗菌藥物的制劑品種進行需氧菌驗證實驗時,可直接以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑(沖洗量為500 mL)進行薄膜過濾法驗證。

綜上所述,可采用薄膜過濾法對速康寧滴眼液進行無菌檢查,但需要采用聚山梨酯80類非離子表面活性劑作為沖洗劑對枯草芽孢桿菌進行檢測;薄膜過濾法和傾注平皿法均可用于速康寧滴鼻液的微生物限度檢查,但對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌進行微生物限度檢查時,建議以含0.1%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為沖洗劑進行薄膜過濾法檢查,而對于霉菌和酵母菌,采用傾注平皿法進行微生物限度檢查即可獲得較好的結(jié)果。