單 麗，朱曉力，向程程，張 媛，顧國建，程 旭

（蘇州大學(xué)附屬太倉醫(yī)院/太倉市第一人民醫(yī)院血液腫瘤科1，病理科2，江蘇 蘇州 215400）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma）的發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的3%，占成人腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的85%～90%，為泌尿系統(tǒng)第2 大惡性腫瘤，其中腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）占腎細(xì)胞癌的85%[1]。對(duì)KIRC 預(yù)后的判斷目前尚缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)記以及模型。細(xì)胞分裂相關(guān)基因NUF2（Ndc80 kinetochore complex component）在細(xì)胞有絲分裂過程中起到穩(wěn)定著絲粒和使染色體正確分離的作用[2]。據(jù)報(bào)道[3]，NUF2 在多種惡性腫瘤中均有較高表達(dá)，并且對(duì)腫瘤的形成和發(fā)展起著重要作用。鐵調(diào)素基因（HAMP）作為系統(tǒng)鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，也已經(jīng)被報(bào)道和很多的惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。既往研究證實(shí)NUF2 及HAMP基因與KIRC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。因此本研究結(jié)合TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了基于NUF2 mRNA、HAMP mRNA、分期、病理分級(jí)及年齡的預(yù)后評(píng)估模型，以對(duì)KIRC 患者的預(yù)后做出精準(zhǔn)的判斷。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）獲取了537 例腎透明細(xì)胞（KIRC）癌患者及72 例正常對(duì)照患者的mRNA 數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的臨床資料。

1.2 方法 按照表達(dá)是否大于平均值分為高表達(dá)及低表達(dá)組。分析NUF2 及HAMP mRNA 在KIRC 中的表達(dá)情況與總生存期（OS）及的關(guān)系。根據(jù)多因素COX 分析中的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素構(gòu)建患者OS的預(yù)后評(píng)估模型,具體計(jì)算公式如下：風(fēng)險(xiǎn)因子=Coefi：風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，xi: NUF2 及HAMP（低表達(dá)0 分，高表達(dá)1 分），分期（1～4 分），病理分級(jí)（1～3 分），年齡（≤60 歲0 分，＞60 歲1 分）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)因子構(gòu)建OS 的預(yù)后評(píng)估模型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 由R 軟件（版本號(hào)3.6.2）完成分析。NUF2 及HAMP mRNA 與對(duì)照組區(qū)別采用t檢驗(yàn)、生存分析采用Kaplan-Meier 法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NUF2 及HAMP mRNA 及其他臨床病理參數(shù)與OS 的關(guān)系采用多因素COX 回歸分析法；R 插件RMS 用來構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型。風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC 分析采用R 插件survivalROC，熱圖分析采用插件pheatmap，數(shù)據(jù)可視化由R 插件Ggplot2繪制。

2 結(jié)果

2.1 KIRC 患者特征 共521 例有完整的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床病理特征數(shù)據(jù)；其中＞60 歲者260 例，≤60 歲者261 例；男339 例，女182 例；Ⅰ+Ⅱ期315 例，Ⅲ+Ⅳ期206 例；G1+G2級(jí)240 例，G3+G4級(jí)281 例。

2.2 KIRC 患者NUF2 mRNA 表達(dá)情況及與OS 的關(guān)系 KIRC 患者的NUF2 mRNA 及HAMP mRNA 的表達(dá)在患者分別為（0.747±1.771）FPKM 及（0.566±1.071）FPKM，高于對(duì)照組的（0.191±0.360）FPKM 及（0.042±0.071）FPKM，見圖1。KIRC 患者的NUF2 及HAMP mRNA 與生存明顯相關(guān)，高表達(dá)NUF2 及HAMP mRNA 的5 年生存率分別為54.7%及52.9%，低于低表達(dá)NUF2 及HAMP mRNA 的3 年生存率，分別為72.8%及74.9%，見圖2。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者與對(duì)照組NUF2 及HAMPmRNA 表達(dá)

圖2 高表達(dá)與低表達(dá)NUF2 及HAMP mRNA 患者的OS 差異

2.3 COX 回歸分析結(jié)果 多因素COX 分析表明，NUF2 mRNA、HAMP mRNA、年齡、AJCC 分期及病理分級(jí)時(shí)患者OS 的獨(dú)立預(yù)后因素，見表1 及圖3。

圖3 多因素COX 回歸分析森林圖

表1 COX 回歸分析結(jié)果

2.4 預(yù)后評(píng)估模型的構(gòu)建 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建了預(yù)后評(píng)估模型來預(yù)測患者1、3、5 年的生存概率。根據(jù)NUF2mRNA、HAMP mRNA、分期、病理分級(jí)及年齡構(gòu)建了患者的OS 預(yù)后評(píng)估模型，見圖4。

圖4 OS 預(yù)后評(píng)估模型Nomogram

2.5 預(yù)后評(píng)估模型對(duì)患者OS 的評(píng)估 高風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS 明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者（P=1.1E-11），1、2、3年OS 分別為81.4、70.7%及60.5%，見圖5。1、2、3年的ROC 曲線下面積分別為0.816、0.800 及0.793，見圖6。Heatmap、Risk score 和survstat 圖均表明采用預(yù)后評(píng)估模型能將高風(fēng)險(xiǎn)及低風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS狀態(tài)明顯的區(qū)分開，見圖7。

圖5 高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS 差異

圖6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型1、2、3 年的ROC 曲線

圖7 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者OS 預(yù)后評(píng)估模型評(píng)價(jià)

3 討論

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤。2015 年，我國腎細(xì)胞癌新發(fā)病例數(shù)為66 800 例（男性43 200例，女性23 600 例），占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的1.56%，在所有惡性腫瘤發(fā)病中排第14 位。腎細(xì)胞癌患者死亡例數(shù)為23 400 例（男性15 200 例，女性8200 例），占全部惡性腫瘤死亡例數(shù)的0.83%，在所有惡性腫瘤死亡率中排名第17 位[5]。外科手術(shù)切除是腎細(xì)胞癌最好的治療方法，但是約有高達(dá)40%的患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。因此，能早期診斷并判斷患者預(yù)后的生物指標(biāo)對(duì)提高患者生存有重要的意義。目前由于KIRC 是最常見腎細(xì)胞癌組織學(xué)類型，本研究的重點(diǎn)分析KIRC。

基因組的不穩(wěn)定狀態(tài)是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的特征之一[7]，而NUF2 的異常表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。孫景波等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，NUF2 在乳腺癌中高表達(dá)，且高表達(dá)組比低表達(dá)組具有較短的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期，可作為不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。國外的研究也發(fā)現(xiàn)通過抑制NUF2 的表達(dá)，能夠減緩胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌腫瘤細(xì)胞及肺癌的生長[10-13]。Shi L 等[14]發(fā)現(xiàn)NUF2 基因與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后有關(guān)。Zhang H 等[15]對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫的研究發(fā)現(xiàn)，NUF2 基因可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生，侵襲及復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究通過對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，NUF2 mRNA 在KIRC 患者中明顯高于對(duì)照組，而且高表達(dá)NUF2 mRNA 患者的預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者。這些都提示NUF2 在KIRC 患者的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要的作用。

腫瘤細(xì)胞需要豐富的細(xì)胞內(nèi)鐵來供應(yīng)細(xì)胞的增殖、代謝和轉(zhuǎn)移。鐵水平的升高與腫瘤的生長和進(jìn)展呈正相關(guān)[16]。越來越多的研究也表明腎細(xì)胞癌發(fā)生中存在鐵積累[17]。HAMP 基因作為調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵的主要基因的過表達(dá)與各種癌癥類型有關(guān)，包括前列腺癌、結(jié)腸癌等[18，19]。本研究中通過分析TCGA 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HAMP mRNA 在健康對(duì)照組中幾乎檢測不到，但在ccRCC 腫瘤中顯著增加，同樣這也提示HAMP 是KIRC 患者的預(yù)后指標(biāo)之一。

由于目前尚無公認(rèn)的有效的判斷KIRC 患者預(yù)后的指標(biāo)，因此對(duì)KIRC 預(yù)后判斷的模型構(gòu)建研究較多。Zhang D 等[20]利用DNA 甲基化有關(guān)的4 個(gè)基因構(gòu)建了預(yù)后判斷模型，1、3 年的ROC 曲線下面積分別為0.856 及0.800。Wan B 等[21]用7 個(gè)免疫相關(guān)的基因構(gòu)建的預(yù)后判斷模型，3 年的ROC 曲線下面積為0.760。Wu Y 等[22]利用代謝相關(guān)的11 個(gè)基因構(gòu)建了預(yù)后判斷模型，1、3 年的ROC 曲線下面積分別為0.737 及0.687。Guo L 等[23]發(fā)現(xiàn)在肝癌中NUF2與其他4 個(gè)基因一起構(gòu)成的預(yù)后預(yù)測模型可以準(zhǔn)確的預(yù)測肝癌患者的預(yù)后。但是目前尚未檢索到以NUF2 及HAMP 基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建KIRC 預(yù)后判斷模型的研究。多因素COX 分析表明NUF2 mRNA、HAMP mRNA 年齡、AJCC 分期及病理分級(jí)是KIRC患者OS 的獨(dú)立預(yù)后因素，據(jù)此本研究構(gòu)建了預(yù)后評(píng)估模型并制作了列線圖。結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS 明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者，1、2、3 年OS 分別為81.4、70.7%及60.5%。1、2、3 年的ROC 曲線下面積分別為0.816、0.800 及0.793，明顯優(yōu)于前述的各項(xiàng)研究。從Heatmap、Risk score 和survstat 圖上也能看出該模型能很好的將低危及高危組的患者的生存狀態(tài)明顯的區(qū)分開。而且由于該模型是由NUF2 及HAMP 基因與臨床常見年齡、AJCC 分期及病理分級(jí)等指標(biāo)一起構(gòu)建的，因此相對(duì)其他模型來說具有經(jīng)濟(jì)及便利的特點(diǎn)。

總之，NUF2 及HAMP 基因的表達(dá)與KIRC 患者的預(yù)后有關(guān)，可作為KIRC 的獨(dú)立預(yù)后的生物標(biāo)記，基于NUF2 mRNA、分期、病理分級(jí)及年齡構(gòu)建的預(yù)后評(píng)估模型能更準(zhǔn)確的判斷KIRC 患者的預(yù)后。