吳碧蘭，孔秀蓮，朱云中，陳 鈺，高 鳳，潘小鳳

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 南寧 530023）

便秘（constipation）是由于大腸功能紊亂，結(jié)腸傳輸功能低下，內(nèi)容物在腸腔傳輸緩慢導(dǎo)致的一種胃腸道疾病，其病因尚不明確，可能與長期起居不規(guī)律、飲食過于精細(xì)、缺少運(yùn)動(dòng)等相關(guān)。目前對(duì)該病尚無有效的根治方法，因此被WHO 確定成國際性難治疾病。西醫(yī)治療主要以促進(jìn)胃腸動(dòng)力、調(diào)節(jié)胃腸菌群為主，但遠(yuǎn)期效果較不理想，甚至部分藥物易產(chǎn)生耐藥性，而繼續(xù)服用則有增加腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)，停藥后依然會(huì)便秘[1-4]。由于西藥療效的局限性，因此探索中藥治療便秘是臨床研究的重點(diǎn)。中藥治療便秘歷史悠久，在緩解患者癥狀、減少復(fù)發(fā)等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。桃紅大將逐瘀湯作為我院骨科常見組方用藥，主要用于治療急性腰痛癥疼痛，具有活血化瘀、行氣消脹、瀉熱通便的功效，對(duì)預(yù)防便秘也有一定的療效[5，6]。故而在臨床應(yīng)用中對(duì)其組方適當(dāng)加減（大黃、厚樸、枳實(shí)、桃仁、紅花）可取得一定的臨床療效，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析桃紅大將逐瘀湯加減的主要活性化合物及其治療便秘的基因和通路，以期為闡明該組方中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 活性化合物及其作用靶點(diǎn)的篩選 利用中草藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索桃紅大將逐瘀湯加減中“大黃”“厚樸”“枳實(shí)”“桃仁”“紅花”5 味中藥的活性化合物，篩選出同時(shí)滿足的口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性DL＞0.18 化合物作為候選的活性化合物；接著，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫中的Related Targets 功能預(yù)測(cè)出候選的活性化合物作用靶點(diǎn)；并利用基因蛋白注釋信息數(shù)據(jù)庫UniProt（https://www.uniprot.org/）對(duì)篩選出的靶點(diǎn)注釋上基因信息。

1.2 疾病相關(guān)基因及中藥治療的靶基因篩選 使用檢索詞為“constipation”分別在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.Gene-cards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）中篩選出與便秘相關(guān)的基因。為了提高準(zhǔn)確度，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中選擇滿足“Score＞1”條件的基因；然后，使用Rx64 3.6.1 軟件中“VennDiagram”包，使中藥活性化合物作用的靶點(diǎn)和疾病相關(guān)的基因相交集，重疊部分即為桃紅大將逐瘀湯加減的活性化合物治療便秘的直接作用靶基因；最后，再通過Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建中藥的活性化合物-靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出關(guān)鍵的活性化合物。

1.3 靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選采用檢測(cè)蛋白之間相互作用的數(shù)據(jù)庫String 平臺(tái)構(gòu)建靶基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，然后將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入到用Cytoscape3.6.1 軟件，通過“cytoHubba”插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到各個(gè)基因表達(dá)蛋白之間的關(guān)系信息，篩選出較為重要的關(guān)鍵基因。

1.4 靶基因的GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析GO 功能注釋和KEGG 富集途徑可對(duì)相關(guān)基因數(shù)據(jù)集中的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析以及注釋，以便理解基因作用于疾病的潛在機(jī)制。其中，GO 功能注釋主要揭示的是基因所涉及的生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF），而KEGG 富集分析主要揭示的是基因所參與的信號(hào)通路。使用Rx64 3.6.1 中“Bioconductor”包對(duì)靶基因進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 富集分析，設(shè)置P＜0.05，并利用“ggplot2”包繪制出較為顯著的GO 和KEGG 富集柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 桃紅大將逐瘀湯加減中5 味中藥的活性化合物及其作用靶點(diǎn) 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫對(duì)5 味中藥進(jìn)行搜索和篩選，除去重復(fù)的部分共獲得獨(dú)立活性化合物82 個(gè)（3 個(gè)重復(fù)），其中大黃16 個(gè)、厚樸2個(gè)、枳實(shí)22 個(gè)、桃仁23 個(gè)、紅花22 個(gè)，這些活性化合物可作用227 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘靶基因的篩選在GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中篩選出了4663 個(gè)與便秘相關(guān)的基因，將這4663 個(gè)基因與227 個(gè)中藥作用的靶點(diǎn)交集，得到177 個(gè)重疊的基因，即為桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘的靶基因，見圖1。

圖1 桃紅大將逐瘀湯加減與便秘相關(guān)基因交集的韋恩圖

2.3 中藥活性化合物-靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 結(jié)合每一個(gè)中藥的活性化合物可作用的靶點(diǎn)和篩選出的靶基因，準(zhǔn)備好由活性化合物與靶基因關(guān)系的文件，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建活性化合物-靶基因的網(wǎng)絡(luò)（圖2），通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)“degree”得分，篩選出較為重要的活性化合物3 個(gè)：MOL000098（quercetin，槲皮素，分值116 分）、MOL000006（luteolin，木犀草素，分值48 分）、MOL000422（kaempferol，山奈酚，分值43 分）。

圖2 中藥活性化合物-靶基因網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選將交集得到的177 個(gè)靶基因輸入在線數(shù)據(jù)庫String，通過分析得到網(wǎng)絡(luò)有177 個(gè)節(jié)點(diǎn)和3553條關(guān)系邊（圖3）。將PPI 網(wǎng)絡(luò)用軟件中的插件“cytoHubba”進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)“degree”得分，篩選出10 個(gè)較為重要的關(guān)鍵基因（圖4），分別為ALB、AKT1、IL6、JUN、CASP3、VEGFA、IL1B、EGFR、PTGS2、MYC。

圖3 桃紅大將逐瘀湯加減作用的177 個(gè)靶基因的PPI 互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 靶基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因

2.5 GO 和KEGG 富集分析 利用Rx64 3.6.1 中“Bioconductor”包對(duì)177 個(gè)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG富集分析，結(jié)果顯示GO 共有169 個(gè)富集條目，KEGG 共有158 個(gè)富集條目，分別繪制出前20 個(gè)較為顯著的富集條目的柱狀圖（圖5、圖6）。GO 富集分析顯示，177 個(gè)靶基因在nuclear receptor activity、transcription factor activity、direct ligand regulated sequence-specific DNA binding、steroid hormone receptor activity（核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體活性）中顯著富集；KEGG 富集分析顯示，177 個(gè)靶基因顯著富含在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway（AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路）等。

圖5 177 個(gè)靶基因的GO 富集柱狀圖

圖6 177 個(gè)靶基因的KEGG 富集柱狀圖

3 討論

便秘屬于中醫(yī)“大便難”“脾約”等范疇。血瘀是便秘關(guān)鍵病因，血瘀與糟粕內(nèi)停與腸道日久，蘊(yùn)結(jié)成毒，損傷氣血，毒害腸絡(luò)，形成“久病血瘀，瘀毒損絡(luò)”的病機(jī)[7-9]。有研究表明[5，6]，桃紅大將逐瘀湯切中其病機(jī)，運(yùn)用其預(yù)防便秘有一定的療效。本研究在桃紅大將逐瘀湯基礎(chǔ)上化裁，去除檳榔、生姜，加入厚樸、枳實(shí)，取小承氣湯去痞、滿之功，達(dá)到活血化瘀、行氣消脹、瀉熱通便的目的。

本研究初步篩選出桃紅大將逐瘀湯加減中有82 個(gè)活性化合物，有55 個(gè)活性化合物可直接作用于與便秘相關(guān)的基因，其中槲皮素、木犀草素和山奈酚等有效成分發(fā)揮著重要作用，它們均屬于具有抗炎、抗癌和抗氧化等作用的黃酮類化合物。槲皮素可通過抑制炎性因子及細(xì)胞因子的反應(yīng)起到預(yù)防腸道黏膜損傷的作用，從而改善便秘癥狀[10]；同樣，山奈酚也具有控制腸道細(xì)胞過量表達(dá)炎性因子及相關(guān)蛋白的作用[11]。木犀草素可通過降低NO 的含量而發(fā)揮抗炎作用[12]。由于NO 進(jìn)入胃腸道平滑肌細(xì)胞，可使其收縮被抑制，導(dǎo)致胃腸蠕動(dòng)變慢引起便秘的發(fā)生[13]，因此木犀草素通過抑制細(xì)胞因子的表達(dá)改善腸道蠕動(dòng)，進(jìn)而功能起到治療便秘的作用。

本研究進(jìn)一步分析桃紅大將逐瘀湯加減直接作用的177 個(gè)便秘相關(guān)基因，得到ALB、AKT1、IL6、JUN、CASP3、VEGFA、IL1B、EGFR、PTGS2、MYC 等10 個(gè)較為重要的基因。ALB 是編輯表達(dá)成白蛋白的基因，其主要在肝臟中合成，在體內(nèi)發(fā)揮結(jié)合和運(yùn)輸生物活性分子的作用[14]，而腸道蠕動(dòng)功能與ALB 的含量呈正比，當(dāng)ALB 較少時(shí)腸蠕動(dòng)明顯較弱[15]，提高ALB 水平可有效改善便秘[16]。AKT 是一種人類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是AGC 蛋白激酶家族的成員[17，18]，而AKT1 是多種人類惡性腫瘤通路的關(guān)鍵因子，腫瘤通路可通過抑制Cajal 間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而使胃腸動(dòng)力減弱[19-21]。IL6 是由多種細(xì)胞產(chǎn)生具有多效性作用的炎性因子，通過轉(zhuǎn)錄激活子-3 引起腸道炎性反應(yīng)，而抑制腸道中的炎性反應(yīng)可改善腸蠕動(dòng)功能[22]。

另外，本研究對(duì)靶基因進(jìn)行富集分析可知，桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘主要通過核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體活性等發(fā)揮作用，并參與AGERAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等起到調(diào)節(jié)作用。其中，IL-17 信號(hào)通路是一條重要的炎性反應(yīng)通路，而TNF 信號(hào)通路為關(guān)鍵的腫瘤通路，它們均可引起腸道黏膜損傷，從而導(dǎo)致腸蠕動(dòng)減弱，通過藥物控制該通路可有效緩解便秘。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，檢索篩選桃紅大將逐瘀湯加減的活性化合物及其治療便秘的靶基因，再進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，預(yù)測(cè)出桃紅大將逐瘀湯加減中的主要有效成分槲皮素、木犀草素和山奈酚，通過影響ALB、AKT1、IL6 等靶基因，調(diào)節(jié)IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路來抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)控腸道蠕動(dòng)功能，從而達(dá)到治療便秘的目的。