唐建軍，韓春賓，紀玉龍，張劍鋒，姜斯聰

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江西 南昌 330052；2.江西省腫瘤醫(yī)院胸外科，江西 南昌 330029；3.江西省腫瘤醫(yī)院轉化腫瘤研究重點實驗室，江西 南昌 330029；4.江西省腫瘤醫(yī)院病理科，江西 南昌 330029）

在全球所有癌癥類型中，肺癌（lung cancer）的死亡率最高[1]。因此，了解關鍵致癌驅(qū)動因素對疾病生物學和臨床結果的影響對于設計新療法至關重要。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌是肺癌的亞型[2]。NSCLC 被細分為離散的組織學和基因組亞型，每個亞型都表現(xiàn)出獨特的生物學和臨床特征[1]。Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（KEAP1）和核因子E2 相關因子2（NRF2）基因位點的突變是NSCLC 中的常見事件，并導致轉錄因子NRF2（抗氧反應的關鍵調(diào)控因子）的構成穩(wěn)定[3，4]。NRF2 是堿性亮氨酸拉鏈結構域蛋白家族的成員，可調(diào)節(jié)抗氧化酶和含有抗氧化反應元件的細胞保護蛋白基因的表達[5，6]。活性氧（ROS）是氧代謝的部分還原氧副產(chǎn)物[7，8]。ROS 的積累可導致DNA 氧化損傷并促進表觀遺傳改變，從而導致驅(qū)動基因失調(diào)和癌癥發(fā)病機制[9，10]。NRF2 在對損傷和炎癥的抗氧化反應中減輕氧化應激起關鍵作用[10]。它受負調(diào)節(jié)因子KEAP1 蛋白的嚴格調(diào)控，并可與NRF2 蛋白結合，誘導其泛素化和降解[11]。然而，關于NRF2 和KEAP1 在癌癥發(fā)病機制中的作用還缺乏共識。NRF2 被認為是肺癌的致癌基因且與NSCLC的發(fā)病機制和進展有關。并且，肺癌組織中的NRF2上調(diào)也與不良治療預后相關[11-14]。此外，肺癌的誘發(fā)機制似乎不同于在其他器官系統(tǒng)和肺部疾病中觀察到的機制，如肺氣腫[15]、高氧[16]和呼吸道合胞體病毒[17]，這些都是KEAP1 依賴性的。長鏈非編碼RNA（lncRNA）長度＜200 個核苷酸，調(diào)控基因表達和關鍵的生物過程[18]，包括細胞周期、細胞凋亡[19-21]以及染色質(zhì)修飾和重塑。鑒于它們影響著重要的生物過程和許多疾病，增加對其遺傳學和生物學的了解已成為近期研究的新熱點。研究表明[23，24]，lncRNAs 在肺癌發(fā)病機制中調(diào)節(jié)NRF2 表達中的作用。為此，本研究主要探究NRF2 調(diào)控的lncRNA 在功能上與肺癌有關信號通路的關系，揭示在肺癌中NRF2 對lncRNA 調(diào)控的機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源 在TCGA數(shù)據(jù)庫（https://can cergenome.nih.gov/）獲取486 個NSCLC 樣本和50個正常樣本的RNA-seq 數(shù)據(jù)。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）檢查原始數(shù)據(jù)質(zhì)量，通過FASTX-Toolkit v.0.0.13（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）去除低質(zhì)量堿基。從GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE118844）中提取公共NRF2 依賴性轉錄組和H3K27ac 染色質(zhì)免疫沉淀測序數(shù)據(jù)，H3K27ac ChIP-seq 數(shù)據(jù)包括3 組NRF2-KD 肺癌A549 細胞系和3 組用于免疫沉淀的對照細胞，以及兩組DNA 輸入（基因組DNA 作為陰性對照）。RNA-seq 數(shù)據(jù)來自KEAP1 突變條件（NRF2 激活）下的NRF2-KD 和A549 細胞。

1.2 染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）使用Bowtie 2軟件分析公開可用的ChIP-seq 數(shù)據(jù)，將全基因組ChIP-seq 讀數(shù)與人類GRCh38 參考基因組對齊。錯誤發(fā)現(xiàn)率設置為q值＜0.05（Benjamini-Hochberg 調(diào)整的P值）。ChIP-seq 算法（MACS v.14 軟件）的模型分析被用于識別NRF2 依賴的富含H3K27ac 的ChIP-seq 峰；控制樣本被設置為輸入。接下來，使用“bedtools cluster”對每個樣本中的ChIP-seq 峰進行聚類。在TSS 上游10 kb 和下游3 kb 的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了ChIP-seq 啟動子相關的峰相關基因。

1.3 轉錄組測序 使用TopHat2[25]將高質(zhì)量數(shù)據(jù)與GRCH38 參考基因組進行對比，并最多允許4 個錯配（Ensembl 釋放61 預測基因模型）。使用外顯子級估量來改進差異基因表達，通過計算映射到基因外顯子的讀數(shù)量來獲得每個基因的計數(shù)。通過edgeR 軟件[26]使用以下標準來識別DE lncRNA：倍數(shù)變化（FC）≥1.5 或FC≤0.67；和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR，P值≤0.05）。

1.4 LncRNA 預測和方向識別 為了系統(tǒng)地分析lncRNA 表達模式，采用管道法鑒定lncRNA[27]。該程序是根據(jù)Cufflinks 軟件設計的[28]。

1.5 功能富集分析 使用KOBAS2.0 服務器識別GO項、KEGG 和Reactome 路徑[29]。采用超幾何檢驗和Benjamini-Hochberg FDR 調(diào)整的P值來定義各術語的富集度。

1.6 LncRNA-mRNA 共表達網(wǎng)絡分析 使用CNC 網(wǎng)絡來計算TCGA NSCLC 樣本（n=550）中共有l(wèi)ncRNAmRNA 對的PCC（臨界值≥0.4）。使用Cytoscape3.7.2版軟件（The CytoscapeConsortium，SanDiego，CA，USA）對lncRNA-mRNA 網(wǎng)絡進行可視化。

1.7 Kaplan-Meier 生存分析 對不同的上調(diào)和下調(diào)組進行Kaplan-Meier 生存分析并通過R 包（survival and survminer）（https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html）生存分析代碼進行可視化，組間比較采用數(shù)秩檢驗（Log-rank），TCGA NSCLC 數(shù)據(jù)集中的中位基因表達設置為上調(diào)和下調(diào)組的截止值。

1.8 統(tǒng)計學方法 在使用每百萬份轉錄本標準化方法后，將樣本中每個基因的讀?。▋?nèi)部腳本）用于下一代測序數(shù)據(jù)的可視化和基因組注釋。使用R 3.6.1（https://www.r-project.org/）進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 肺癌中NRF2 的過度表達和 KEAP1 突變體A549 細胞中NRF2 結合靶點的鑒定 從486 例癌癥和50 例正常樣本的TCGA 數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)NRF2 在肺癌患者中高表達（圖1A）。NCBI/GEO/H3K27ac/ChIP-seq（GSE118840）數(shù)據(jù)集包含3 個含有NRF2 siRNA（NRF2-KD）的NRF2 敲低A549 樣本，3 個用于免疫沉淀的含有對照siRNA 的對照樣本和兩個以對照siRNA 作為輸入的樣本（基因組DNA）。與NRF2-KD 樣品相比，從3 個對照樣品中特異性鑒定出8277、3808 和6858 個富集峰；而與對照樣品相比，在3 個NRF2-KD 樣品中共發(fā)現(xiàn)2645、5396和4020 個峰（圖1B）。H3K27ac 中超過80%的結合峰的寬度小于2151 bp（圖1C）。對NRF2NRF2 依賴的H3K27ac 峰進行文氏圖分析，并從3 個ChIP-seq重復中至少2 個中確定了3006 個候選NRF2 依賴的H3K27ac 峰（圖1D）。KEGG 富集顯示，NRF2 具有發(fā)揮多方面的潛在作用（圖1E）。依賴于NRF2 的H3K27ac 沉積峰在轉錄起始位點（TSS）附近的10 kb 區(qū)域顯示出較高的比例（15%）（圖1F）。峰的全基因組分布顯示114 個lncRNA、10 個sense_intronic、124 個假基因、3 個sense_overlapping、102 個反義、34 個microRNA（miRNA）、28 個misc_RNA、452 個編碼蛋白，以及71 種其他基因類型（圖1G）。對NRF2 依賴的H3K27ac 峰的基因本體論（GO）分析表明，該峰富集了各種代謝過程（圖1H）。對照樣本和NRF2-KD 樣本中有代表性的lncRNAs 基因組快照（RP11-445P17.8）顯示，與NRF2-KD 樣本相比，對照樣本具有強的H3K27ac 結合峰（圖1I），表明肺癌中上調(diào)的NRF2 可以在lncRNA 位點形成H3K27ac 標記的增強子。

圖1 KEAP1 敲低A549 細胞中NRF2 結合靶點的識別

2.2 NRF2-KD 與具有KEAP1 突變的對照A549 細胞之間的DE lncRNA 分析 結果表明，對照組在TSS 附近有很強的結合模式，而NRF2-KD 組在TSS上的結合微乎其微（圖2A、2B，圖3A、3B）。火山圖和熱圖顯示，NRF2-KD 與對照樣品中有368 個lncRNA 基因表達下調(diào)，404 個表達上調(diào)（圖3C、3D）。使用550 個LUSC 樣本的TCGA 數(shù)據(jù)集通過共表達研究lncRNA 和mRNA 表達之間的關系，DE lncRNA 和共表達mRNA 的GO 和KEGG 功能富集分析見圖3E、3F，表明DE lncRNA 和mRNA 在肺癌進展中發(fā)揮作用。

圖2 NRF2-KD 與具有KEAP1 突變的對照A549 細胞之間的DE lncRNA 分析

圖3 結合DE mRNA 功能途徑的分析

2.3 NRF2 介導的lncRNA 在肺癌中的調(diào)控作用 為了建立NRF2 調(diào)控的lncRNA 與肺癌之間的臨床關系，從數(shù)據(jù)庫中篩選已知的lncRNA，并預測罕見的新lncRNA。GO 和KEGG 分析確定依賴于NRF2 的DE mRNA 和H3K27ac 結合的mRNA 的重疊基因富集途徑，共發(fā)現(xiàn)一組由NRF2 依賴性增強子調(diào)節(jié)的18 個lncRNA（圖4A、4B）。這18 個lncRNA 表達譜的熱圖顯示了兩個不同的簇，一個對應于對照組，另一個對應于NRF2-KD 組。然后，對TCGA LUS 數(shù)據(jù)集中的18 個lncRNA 進行共表達分析，識別它們相關的mRNA。共表達mRNA 分析見圖4C、4D，DE lncRNA-mRNA 通路圖見圖4E。

圖4 NRF2 介導的LncRNA 在肺癌中的調(diào)控作用

2.4 lncRNA LINC00488 對肺癌患者預后的影響 對18 個NRF2 依賴性H3K27ac 結合的lncRNA 進行Kaplan-Meier 生存分析，結果顯示18 個lncRNA 中LINC00488 上調(diào)與預后不良相關。ChIP-seq 結果和RNA-seq 結果中LINC00488 的讀取分布見圖5A、5B、5C；ChIP -seq 分析識別出lncRNA RP11.227H15.4（Chr10:69231262 -69233332）的NRF2 依賴性增強子區(qū)域（圖6A）。此外，Kaplan-Meier 生存曲線顯示，RP11.227H15.4 基因表達上調(diào)的LUSC 患者預后不良（圖6B）。

圖5 lncRNA LINC00488 對肺癌患者預后的影響

圖6 調(diào)節(jié)lncRNA（RP11.227H15.4）對肺癌患者預后的影響

3 討論

肺癌是一種異質(zhì)性疾病，了解關鍵致癌驅(qū)動因素對其生物學和患者臨床結局的影響對于設計新療法至關重要。NSCLC 是最普遍的肺癌類型[30]，lncRNA 參與腫瘤發(fā)生是一個新興的主題[31，32]。LncRNA 可能通過改變基因表達發(fā)揮與經(jīng)典癌基因或腫瘤抑制基因相似的作用[33]。NRF2 在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化微環(huán)境、炎癥反應和細胞穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[34]。此外，它還可以在癌癥中發(fā)揮致癌或保護作用[35-37]。

小的非編碼RNA 在增殖、干細胞自我更新、細胞凋亡和化學/放射抗性等生理過程中發(fā)揮重要作用[38，39]。這些非編碼RNA 也被證明可以在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)癌基因和腫瘤抑制基因。類似地，NRF2 可以通過miRNA 和lncRNA 在遺傳和表觀遺傳水平上對癌基因和腫瘤抑制基因進行調(diào)節(jié)[40，41]。許多研究報道了NRF2 和lncRNAs 在腫瘤進展中的關系。如前列腺癌進展中的NRF2 表達受lncRNA TUG1 調(diào)節(jié)[42]。此外，吸煙和癌癥相關的lncRNA-1/肺癌相關轉錄物1（SCAL1/LUCAT1）的表達受NRF2 在煙草煙霧誘導的肺癌中的調(diào)節(jié)[43]。此外，敲低NRF2 可以降低lncRNA 核缺氧調(diào)節(jié)的NLUCAT1 的表達；而NRF2 的過表達可以提高NLUCAT1 的表達并促進肺腺癌中的順鉑耐藥[44]。因此，探究NRF2-lncRNA 的相互作用至關重要。盡管lncRNA 與調(diào)節(jié)NRF2 基因表達有關，但目前仍缺乏關于其在肺癌中作用的詳細全基因組視圖[45]。

本研究確定了一個依賴DE NRF2 的lncRNA網(wǎng)絡，并通過全基因組RNA-seq 分析以及GO 和KEGG 通路富集分析探索它們在NSCLC 中可能的臨床意義，結果顯示其主要涉及的通路有：細胞色素P450 介導的異生物代謝，硫酸角質(zhì)素糖胺聚糖生物合成和細胞色素P450 介導的藥物代謝、代謝途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，類固醇激素生物合成，化學致癌，卟啉和葉綠素代謝。值得注意的是，對A549 細胞（GSE118844）中NRF2 依賴性H3K27ac ChIP-seq 數(shù)據(jù)和NRF2-KD RNA-seq 數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)了368 個lncRNA 基因表達下調(diào)，404 個表達上調(diào)，并且共表達的mRNA具有自身免疫性疾病介導的細胞毒性、自噬調(diào)節(jié)、IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡、RIG-Ⅰ樣受體信號通路和細胞粘附分子的富集。至少2 個DNA 樣本和3006 個候選NRF2 依賴的H3K27ac 峰。該峰富集了各種代謝過程，如小分子代謝、受體介導的內(nèi)吞作用、硫酸角質(zhì)素生物合成、有絲分裂的G1/S 轉換、水溶性維生素代謝和小GTPase 介導的信號轉導的調(diào)節(jié)。本研究表明，NRF2 上調(diào)可以誘導細胞周期從G0/G1期向S 期轉變，促進人支氣管上皮細胞的腫瘤發(fā)生[46]，以及NRF2 在抗氧化防御、NADPH 的再生和其他代謝途徑中的作用[13，23]。本研究發(fā)現(xiàn)了18 個lncRNA 共表達mRNA，表明這些基因可能與RNA剪接、DNA 依賴性DNA 修復、mRNA 加工、轉錄調(diào)控、有絲分裂、DNA 復制和轉錄激活可能關聯(lián)。對共表達mRNAs 的KEGG 分析預測了與剪接體、谷胱甘肽代謝、賴氨酸降解、細胞色素P450 介導的異生物質(zhì)代謝、同源重組、細胞周期、RNA 轉運、泛素介導的蛋白水解和胞質(zhì)鐵硫簇組裝途徑的關聯(lián)。最后發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00488 的高表達與肺癌患者預后不良有關。而lncRNA LINC00488 與許多癌癥有關，如通過miR-376a-3p/PON2 的甲狀腺癌[47]和通過miRNA-485-5p 的食道癌[48]。未來的研究將探索利用功能性敲入和敲除實驗闡明NRF2-lncRNA LINC00488 在肺癌中的調(diào)控機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00488 可能在肺癌中受到NRF2 的潛在調(diào)節(jié)，其可能作為新的預后生物標志物和肺癌治療靶點的潛在作用。但需要進一步的實驗來闡明lncRNA 對NRF2 表達及其下游靶點在癌癥進展中的互補作用。