邱世婷，侯雪*，雷紹榮，韓梅，賀光云，李瑩，覃蜀迪

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸及其4種前體化合物含量

邱世婷1,2，侯雪1,2*，雷紹榮1,2，韓梅1,2，賀光云1,2，李瑩1,2，覃蜀迪1,2

1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，四川 成都 610066； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（成都），四川 成都 610066

煙酰胺核糖體（NR）、煙酰胺單核苷酸（NMN）、煙酸（NA）和煙酰胺（NAM）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的4個(gè)前體化合物，口服后可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為NAD+發(fā)揮抗衰老等功效。建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定茶葉中NAD+及其4種前體化合物含量的方法，茶葉經(jīng)水提取，稀釋后直接進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，5種目標(biāo)化合物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（2≥0.99），回收率為70.00%～120.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%～14.50%，方法的定量限為0.10～0.50?μg·L-1。綠茶、紅茶和黑茶中5種目標(biāo)化合物的含量測(cè)定結(jié)果顯示，綠茶和紅茶是NR、NMN、NAD+的良好天然食物來(lái)源；主成分分析結(jié)果顯示，根據(jù)5種化合物含量能對(duì)紅茶、綠茶、黑茶進(jìn)行良好的類群區(qū)分；聚類分析結(jié)果顯示，同一產(chǎn)地同一類型茶葉中5種化合物質(zhì)量分布不均，離散度較高，無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。

茶葉；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；煙酰胺單核苷酸；煙酰胺核糖體；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+，輔酶Ⅰ）是一種參與人體各種生理過(guò)程的輔酶，在維持細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和能量代謝及細(xì)胞保護(hù)方面起著重要作用[1-2]。人體中NAD+水平會(huì)隨著年齡增加而不斷下降[3-4]，從而引起機(jī)體一系列生理機(jī)能衰退和退行性病變[5-6]，如何恢復(fù)衰老機(jī)體內(nèi)正常NAD+水平，已成為目前研究的熱點(diǎn)。由于NAD+分子過(guò)大，直接口服很難穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入體內(nèi)[7]，口服其前體化合物是提升體內(nèi)NAD+水平的手段之一。煙酰胺（Nicotinamide，NAM）和煙酸（Nicotinic acid，NA）兩種化合物被認(rèn)為是合成NAD+的兩個(gè)膳食前體[8]，但兩者大劑量使用對(duì)人體均存在副作用，如煙酸易引起人體面部潮紅，煙酰胺會(huì)引起肝臟毒性等[9-10]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺的核糖化形式煙酰胺核糖體（Nicotinamide riboside，NR）及NR的磷酸化形式煙酰胺單核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）也是NAD+合成的重要細(xì)胞外前體化合物[11-12]。NMN是NAD+最直接高效的前體物質(zhì)，NR功效雖僅有NMN的1/150[7]，但已有多項(xiàng)研究證明體外補(bǔ)充NMN或NR可顯著增加動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)NAD+含量[13]，發(fā)揮抗衰老、增強(qiáng)細(xì)胞活力、減弱認(rèn)知退化等作用[14-17]，同時(shí)對(duì)人體無(wú)毒副作用[18]。Mills等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NMN給藥含量為100?mg·kg-1·d-1時(shí)，能夠減輕小鼠大多數(shù)與年齡相關(guān)的生理衰退疾病，而人類的等效表面積劑量為8?mg·kg-1·d-1。Yoshino等[17]匯總了NAD+的兩個(gè)中間體預(yù)防和治療與年齡相關(guān)的生理衰退和疾病的相關(guān)實(shí)例，發(fā)現(xiàn)NAD+中間體與哺乳動(dòng)物衰老和長(zhǎng)壽控制機(jī)理有關(guān)。NMN和NR逐漸成為醫(yī)藥保健等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前NMN和NR在日本和美國(guó)已作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的原料進(jìn)入抗衰老領(lǐng)域市場(chǎng)，價(jià)格十分昂貴[19]。但在我國(guó)NMN和NR尚未取得相關(guān)許可，膳食攝入仍是其主要獲取途徑，尋找NMN和NR良好的天然食物來(lái)源也受到了研究者的關(guān)注[20]。NMN、NR、NAM和NAD+已被報(bào)道存在于多種天然食物來(lái)源中，NR目前僅有乳品中的含量報(bào)道，具體情況見(jiàn)表1。

茶葉具有抗衰延老[22]和改善心血管疾病等一系列特殊保健功能[23]，這些功效與NAD+及其4個(gè)前體化合物的功能具有較大的相似性。NAD+及其4個(gè)前體化合物極性大，難揮發(fā)，易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑[20,24-25]，目前已報(bào)道的定量方法有液相色譜-紫外法[25-26]、液相色譜-質(zhì)譜法[7,19-20,24]、酶聯(lián)免疫法[8]等，主要集中在生物組織、細(xì)胞、蔬菜和水果[27]等基質(zhì)中，且多為單一化合物含量測(cè)定，未見(jiàn)茶葉中NAD+及其4個(gè)前體化合物含量同時(shí)測(cè)定方法研究報(bào)道。

基于茶葉中NAD+及其4個(gè)前體化合物物質(zhì)微量存在，且茶葉基質(zhì)復(fù)雜，干擾性強(qiáng)，本研究以靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀為分析儀器，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法和色譜條件，以綠茶、紅茶和黑茶為研究對(duì)象，建立同時(shí)快速測(cè)定茶葉中NAD+及其4個(gè)前體化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），測(cè)定綠茶、紅茶和黑茶中NAD+及其4個(gè)前體化合物的含量，并運(yùn)用主成分分析等比較不同類型茶葉、不同產(chǎn)地茶葉中5種目標(biāo)化合物的成分差異，以期為茶葉營(yíng)養(yǎng)功效成分揭示和大健康產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

表1 5種化合物在天然食物中的含量

注：“—”表示未查詢到相關(guān)數(shù)據(jù)，ND表示未檢出

Note: “—” indicates that no relevant data has been queried, ND indicates not detected

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

104個(gè)供試茶葉樣品取自四川省主要茶葉生產(chǎn)基地和合作社，包含75個(gè)綠茶（綿陽(yáng)市21個(gè)、瀘州市27個(gè)、雅安市27個(gè)），14個(gè)紅茶（綿陽(yáng)市5個(gè)、瀘州市3個(gè)、雅安市6個(gè)），15個(gè)黑茶（雅安市），均為2022年上半年生產(chǎn)。

NMN（純度≥95%）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，NR（純度95.8%）和NAD+（純度92.5%）購(gòu)自上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，NA（純度99.9%）和NAM標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）購(gòu)自廣州佳途科技股份有限公司，超純水（實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水）由Milli-Q超純水機(jī)制備，乙腈（色譜純）和甲醇（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司，甲酸（色譜純）購(gòu)自德國(guó)CNW公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-MS 8060超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；Multi Reax多位試管渦旋振蕩器，德國(guó)海道夫公司；JY2002電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海力康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Waters anionic polar pesticide色譜柱（100?mm×2.1?mm，5?μm），柱溫為50?℃，流速為0.5?mL·min-1，進(jìn)樣量為10?μL；流動(dòng)相A為0.9%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.9%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～4?min，0%～15% B；4～7?min，15% B；7～8?min，15%～90% B；8～12?min，90% B。

表2 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

注：*為定量離子

Note:*Quantitative ion

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源為電噴霧電離（Electron spray ionization，ESI）源，接口電壓為4?000?V，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）模式，霧化氣流速為3?L·min-1，干燥氣流速為10?L·min-1，加熱氣流速為10?L·min-1，接口溫度為300?℃，脫溶劑管溫度為250?℃，加熱模塊溫度為400?℃。其他質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

1.3.3 樣品前處理

稱取0.25?g粉碎的茶葉樣品，置于50?mL離心管中，加入25?mL水提取，渦旋振蕩40?min，8?000?r·min-1離心5?min，取10?μL上清液用乙腈稀釋至1?mL，過(guò)0.22?μm濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2021、SIMCA 14.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖；采用SPSSAU軟件進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將5種化合物單獨(dú)配制成1?mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，經(jīng)掃描發(fā)現(xiàn)，5種化合物的母離子峰均為[M+H]+峰，將其作為母離子，利用儀器自帶自動(dòng)優(yōu)化程序，進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞電壓（CE）、Q1偏差（V）、Q3偏差（V）等參數(shù)，在MRM模式下選取響應(yīng)高、離子比穩(wěn)定的離子作為子離子，最終形成的MRM掃描參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

5種化合物屬于親水性化合物，極性大，故5種化合物在傳統(tǒng)的反相色譜柱中基本無(wú)保留[24]，參照文獻(xiàn)[25]條件，選用C18反相色譜柱，5種化合物出峰時(shí)間在3?min以內(nèi)（圖1A），且NAD+靈敏度低。利用5種化合物高親水性和強(qiáng)極性特點(diǎn)，本研究選擇Waters Anionic Polar Pesticide陰離子交換柱，其固定相由具有三鍵鍵合二乙胺（Diethylamine，DEA）鍵合相的亞乙基橋雜化（Bridge ethylidene hybrid，BEH）顆粒組成，兼具親水性表面和陰離子交換特性，適合用于保留和分離極性陰離子化合物。5種目標(biāo)化合物均含有羧酸或膦酸基團(tuán)，在弱酸性溶液中帶負(fù)電，通過(guò)陰離子交換作用可實(shí)現(xiàn)色譜分離，因此流動(dòng)相中需加入0.9%甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，在此酸性條件下5種化合物分離效果和峰形均較好（圖1B），加入甲酸銨后NR峰形拖尾，靈敏度降低。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

已有研究報(bào)道[19,27]，不同濃度甲醇提取液對(duì)食品原料中NMN含量測(cè)定有一定影響，本研究考察了水、5%、10%、20%、30%、40%、50%甲醇水溶液對(duì)3種茶葉中5種化合物提取效果，平行6次。由圖2可知，3種茶葉中NMN和NAD+峰面積隨提取溶劑中甲醇含量的增加而降低，NR峰面積隨提取溶劑中甲醇含量的增加而增加，NA和NAM峰面積基本不受提取溶劑中甲醇含量的影響。由于NR含量較低，考慮提取溶劑的環(huán)保型和茶葉日常飲用習(xí)慣，最終本研究選取水為提取溶劑。

2.3.2 提取溫度的選擇

分析了提取溫度為常溫（約20?℃）、50?℃、80?℃時(shí)對(duì)3種茶葉中5種化合物的提取效果。測(cè)定了不同溫度下目標(biāo)化合物的峰面積，平行6次，利用單因素方差分析研究溫度對(duì)于目標(biāo)化合物提取效果的差異性。從表3可以看出，不同溫度對(duì)于NMN、NAD+、NR提取有顯著性差異（<0.05），而對(duì)NAM和NA無(wú)顯著性差異（>0.05）。通過(guò)峰面積比較，可見(jiàn)茶葉中NMN和NAD+峰面積隨提取溫度升高而下降，NR峰面積隨提取溫度升高而升高，最終本研究選擇常溫為提取溫度。

2.3.3 提取時(shí)間的選擇

以綠茶為例，比較分析提取時(shí)間為5、10、20、30、40、50、60?min時(shí)，5種目標(biāo)化合物的提取峰面積。從表4可以看出，不同提取時(shí)間對(duì)于NR、NAM、NMN提取有顯著性差異（<0.05），而對(duì)NA和NAD+無(wú)顯著性差異（>0.05）。通過(guò)峰面積比較可知，NR、NAM和NMN提取時(shí)間為40?min時(shí)峰面積達(dá)到平衡，40?min后繼續(xù)增加提取時(shí)間，峰面積增加不明顯，故本研究選擇提取時(shí)間為40?min。

注：A為C18柱，B為Waters Anionic Polar Pesticide柱（1-NR；2-NA；3-NAM；4-NMN；5-NAD+）

圖2 不同提取溶劑對(duì)3種茶葉中目標(biāo)化合物的提取效果比較

表3 不同提取溫度方差分析結(jié)果（n=6）

注：ND表示未檢出，*<0.05，**<0.01。下同

Note: ND indicates not detected. *<0.05, **<0.01. The same below

2.3.4 去除茶葉基質(zhì)效應(yīng)方法的選擇

茶葉基質(zhì)在液質(zhì)串聯(lián)色譜中通常表現(xiàn)出非常強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，常見(jiàn)的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法有同位素標(biāo)記、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、稀釋補(bǔ)償?shù)萚28]。由于茶葉中含有目標(biāo)化合物，無(wú)法取得空白基質(zhì)，且目前缺乏同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，故本研究首先選擇稀釋補(bǔ)償法去除基質(zhì)效應(yīng)，將提取后的母液用乙腈溶劑稀釋100倍后獲得基質(zhì)稀釋液。分別采用乙腈和基質(zhì)稀釋液配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)考察基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)（ME）的計(jì)算公式如下：

=[(－ck)/－1]×100%

其中，為基質(zhì)效應(yīng)值，為目標(biāo)物在基質(zhì)中的峰面積，ck為目標(biāo)物在基質(zhì)空白中的峰面積，為目標(biāo)物在溶劑中的峰面積。強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)：＞50%或＜–50%；中基質(zhì)效應(yīng)：–50%≤≤–20%或50%≤≤20%；弱基質(zhì)效應(yīng)：–20%＜＜20%[29]。不同茶類對(duì)不同目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)不同（表5），選擇稀釋補(bǔ)償后，NR由于出峰時(shí)間早，受基質(zhì)影響大，仍為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，為補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)對(duì)NR的影響，本研究采用黑茶作為空白基質(zhì)配備標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線對(duì)NR進(jìn)行定量校準(zhǔn)（黑茶中NR為未檢出）；其余4種化合物采用稀釋補(bǔ)償法后基質(zhì)效應(yīng)均為弱基質(zhì)效應(yīng)，且無(wú)法獲得此4種化合物的空白基質(zhì)，故NAM、NA、NMN、NAD+采用試劑標(biāo)樣外標(biāo)曲線法進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.4 線性范圍、方法檢出限和定量限

按照儀器信噪比（S/N）為3計(jì)算方法檢出限，以儀器信噪比（S/N）為10計(jì)算方法定量限，方法檢出限為0.05～0.10?μg·L-1；定量限為0.10～0.50?μg·L-1。NR標(biāo)準(zhǔn)品用黑茶基質(zhì)稀釋液配制成0.1、0.5、1、5、10、20、50?μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)溶液，NAM、NA、NMN、NAD+用乙腈分別配制為0.1、0.5、1、5、10、20、50?μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)溶液，以5種化合物峰面積（）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（，μg·L-1）為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性方程，結(jié)果見(jiàn)表6。NA在0.5～50?μg·L-1線性關(guān)系良好，其余4種化合物在0.1～50?μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

2.5 回收率與精密度

以綠茶、紅茶和黑茶為基質(zhì)，在接近基質(zhì)本底濃度1～10倍的濃度水平下進(jìn)行了添加回收率試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了高低兩個(gè)添加濃度，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，由表7可知，5種化合物回收率在70.00%～120.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）為2.09%～14.50%。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照溶液、綠茶供試溶液分別在制備好后0、2、6、12、18、24?h進(jìn)樣測(cè)定各目標(biāo)化合物的峰面積，5種化合物的峰面積RSD范圍為3.51%～8.18%，說(shuō)明以上溶液在24?h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 實(shí)際樣品含量測(cè)定

應(yīng)用該方法對(duì)四川省瀘州市、雅安市和綿陽(yáng)市3個(gè)產(chǎn)地采集的104個(gè)茶葉樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示（表8），不同種類的茶葉5種化合物含量差異明顯，綠茶中NAD+含量最高，紅茶中NMN含量最高，綠茶和紅茶中NR含量差異不大，黑茶中NR、NMN和NAD+含量最低。說(shuō)明茶葉中的NMN、NAD+、NR含量差異可能與茶葉品種、采摘時(shí)期、加工工藝和貯存時(shí)間等因素密切相關(guān)。

表4 不同提取時(shí)間方差分析結(jié)果（綠茶，n=6）

表5 5種化合物在綠茶、紅茶和黑茶中的基質(zhì)效應(yīng)

表6 5種化合物的線性關(guān)系、檢出限和定量限

注：*采用黑茶基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線

Note: * The standard curve was prepared by dark tea matrix

表7 5種化合物的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

注：BC表示本底濃度，LCA表示低濃度添加，PD表示實(shí)際測(cè)定值，AR表示平均回收率，RSD表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，HCA表示高濃度添加

Note: BC represents the background concentration. LCA represents low concentration addition. PD represents the practical determination value. AR represents average recovery. RSD represents relative standard deviation. HCA represents high concentration addition

每100?g綠茶和每100?g紅茶中NMN含量分別為(0.30±0.19)?mg、(0.99±0.33)?mg，高于已報(bào)道的部分蔬菜和海產(chǎn)品中NMN含量[14]，且每100?g綠茶和每100?g紅茶中NAD+含量分別為(8.76±2.99)?mg、(4.45±2.23)?mg，高出已報(bào)道的鐵皮石斛（鮮品）中NAD+的含量[7]。綠茶和紅茶中均有NR檢出，而黑茶中未檢出，目前僅有牛奶中也有檢出微量NR報(bào)道[8]，故無(wú)法進(jìn)行比較?？梢?jiàn)，綠茶和紅茶是補(bǔ)充NR、NMN、NAD+的良好食物來(lái)源。

2.8 正交偏最小二乘判別分析

為更好地比較3種茶葉樣品的組間差異，以茶葉中5種目標(biāo)化合物含量為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。結(jié)果顯示，該5種化合物含量能對(duì)紅茶、綠茶、黑茶進(jìn)行良好的類群區(qū)分（圖3A），其中2為0.946，2為0.883，2為0.865（2和2分別表示所建模型對(duì)和矩陣的解釋率，通過(guò)交叉驗(yàn)證計(jì)算得出的2則用以評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力[30]）。同時(shí)比較75個(gè)綠茶產(chǎn)地的組間差異（圖3B），模型效果欠佳，基本無(wú)法對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。同一類型茶葉不同產(chǎn)地含量差異說(shuō)明茶葉生長(zhǎng)環(huán)境也能影響茶葉中NAD+及其4種前體化合物含量。

2.9 聚類分析

采用SIMCA 14.1軟件，以茶葉中5種目標(biāo)化合物含量為變量，采用組間聯(lián)接方法對(duì)73個(gè)來(lái)自不同產(chǎn)地的綠茶進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。樣品間判別距離越小，說(shuō)明樣品相似度越高。瀘州、雅安和綿陽(yáng)三地綠茶樣品僅部分相鄰，大部分相隔較遠(yuǎn)，各地整體相似度較低，5種化合物含量分布不穩(wěn)定，無(wú)明顯地域規(guī)律。綜合聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚類分布與主成分分析結(jié)果相互印證，說(shuō)明兩種分析分類結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本研究首次建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中NAD+及其4種前體化合物含量方法，該法前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確度高、干擾少。通過(guò)測(cè)定首次報(bào)道了茶葉中NAD+及其4種前體化合物的含量，這可能是茶葉抗衰延老功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)建立的檢測(cè)方法可簡(jiǎn)便快速追蹤茶葉生長(zhǎng)、加工、儲(chǔ)存過(guò)程中NMN、NR和NAD+的含量變化，為不同茶葉進(jìn)一步資源開(kāi)發(fā)及大健康產(chǎn)品研發(fā)提供更加全面的技術(shù)支持。

表8 每100?g綠茶、紅茶、黑茶中5種化合物含量

圖3 不同類型（A）和不同產(chǎn)地（B）茶葉主成分分析圖

圖4 不同產(chǎn)地綠茶中5種成分含量聚類圖

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Simultaneous Determination of Nicotinamide Adenine Dinucleotide and Its Four Precursors in Tea by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QIU Shiting1,2, HOU Xue1,2*, LEI Shaorong1,2, HAN Mei1,2, HE Guangyun1,2, LI Ying1,2, QIN Shudi1,2

1. Institute of Quality Standard and Testing Technology Research, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China; 2. Laboratory of Risk Assessment for Agricultural Product (Chengdu), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chengdu 610066, China

Nicotinamide ribosome (NR), nicotinamide mononucleotide (NMN), nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NAM) are 4 precursor compounds of NAD+, which can be converted to NAD+to work after oral administration. This study established a method for simultaneous determination of NAD+and its four precursors in tea by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The tea samples were extracted by water, then diluted and directly analyzed by UPLC-MS/MS. Method validation shows this method has good linearity in their respective range with correlation coefficients (2) higher than 0.99. The average recoveries ranged from 70.00 % to 120.00% with relative standard deviations (RSDs) of 2.09%-14.50%. The limits of quantitation (LOQs) were 0.10-0.50?μg·L-1. The determination results of five target compounds in green tea, black tea and dark tea show that green tea and black tea were the good natural food sources of NR, NMN, NAD+. The results of principal component analysis show that the contents of five compounds could well distinguish black tea, green tea and dark tea. The cluster analysis shows the same type of tea from the same origin was of uneven quality, with high dispersion in samples, and it was difficult to identify each other.

tea, nicotinamideadenine dinucleotide (NAD+), nicotinamide nononucleotide (NMN), nicotinamide riboside (NR), UPLC-MS/MS

S571.1；O657

A

1000-369X(2023)02-216-11

2023-01-04

2023-03-03

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP20220207）

邱世婷，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)。*通信作者：houxue127@163.com