張?zhí)煲?高楊 馬堯 任明智 王孝彬 馬駿

肺癌是高死亡率和高患病率的惡性腫瘤,肺腺癌是肺癌中非小細肺癌的主要病理類型[1-2]。盡管綜合診斷治療技術(shù)獲得了進步,但肺腺癌病人預(yù)后仍然較差[3]。因此,迫切需要鑒定參與肺腺癌的關(guān)鍵分子,以制定早期診治策略并改善臨床預(yù)后。長鏈非編碼核糖核酸(long noncoding ribonucleic acids,lncRNA)的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生和進展有關(guān)。已報道大量lncRNA的存在,但大多數(shù)lncRNA的生理功能知之甚少[4-5]。LINC01197在胃癌中高表達,下調(diào)其表達可抑制胃癌進展[6]。然而,尚少見探索LINC01197在肺腺癌中的表達以及相關(guān)的功能機制的報道。Notch信號通路是發(fā)育生物學(xué)中一條高度保守的途徑。在與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細胞增殖、分化和死亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[7]。有研究表明,阻斷Notch信號通路可抑制肺腺癌細胞侵襲[8]。因此推測LINC01197可能通過調(diào)節(jié)Notch信號通路來抑制腫瘤的發(fā)生。

對象與方法

一、對象

本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會批準。收集2019年9月～2020年9月接受手術(shù)治療的15例肺腺癌病人癌組織和癌旁正常組織樣本。所有病人術(shù)前均未接受放療或化療,并已簽署知情同意書。HBE、肺腺癌細胞系(A549、H1299)均購自美國ATCC。攜帶完整LINC01197轉(zhuǎn)錄物(LINC01197)與其空載對照(Vector)或靶向LINC01197的shRNA(sh-LINC01197)與其陰性對照(sh-NC)的慢病毒構(gòu)建體由上海GenePharma提供。Notch信號激活劑重組Jagged-1/Fc(純度>90%)和抑制劑-分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor,GSI,HPLC≥95%)均獲自美國Sigma-Aldrich;SYBR Premix EX Taq獲自日本TAKARA;RIPA裂解液獲自上海Beyotime;一抗Notch1、Hes1和β-actin獲自北京Annoron;MTT溶液獲自上海Yaji。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)與處理:HBE、A549和H1299細胞常規(guī)培養(yǎng)。A549細胞分為Control組、LINC01197組、Vector組、LINC01197+Jagged-1/Fc(1 mM)組[9];H1299細胞分為Control組、sh-LINC01197組、sh-NC組、sh-LINC01197+GSI(500 μg/L)組[10],終濃度為2 mg/ml的不同慢病毒構(gòu)建體對應(yīng)轉(zhuǎn)染。48小時后通過驗證LINC01197轉(zhuǎn)染效率,并進行后續(xù)實驗。

2.qRT-PCR:Trizol分離總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過SYBR Premix Ex Taq和特異性引物進行擴增分析。LINC01197-F:5'-CCAAATCCTCGGTGCTGTGA-3'和LINC01197-R:5'-TGCCTCTGTACGCAGATTCC-3';β-actin-F:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'和β-actin-R:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。LINC01197標準為β-actin表達水平。

3.免疫印跡:RIPA裂解獲取蛋白質(zhì)。經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后添加一抗在4℃過夜,添加二抗孵育?；瘜W(xué)發(fā)光法可視化。

4.MTT檢測:細胞以3×103個/孔種植在96孔板中,48小時后添加20 μL的MTT,孵育4小時。酶標儀在490 nm處檢測吸光度。

5.集落形成實驗:大約100個/孔種植在6孔板中,孵育14天。甲醇固定30分鐘,0.5%結(jié)晶紫染色1小時,用顯微鏡對集落進行拍照和計數(shù)(>50個細胞)。

6.Transwell實驗:將實驗前24小時用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞以1×104個/孔種植在涂有Matrigel的Transwell的上室中,下室中添加600 μL正常培養(yǎng)基。24小時后,多聚甲醛固定后通過結(jié)晶紫染色。顯微鏡觀察。

7.裸鼠腫瘤生長:10只無特定病原體(SPF)BALB/c雌性裸鼠(4～6周齡,18～22 g)購自中國科學(xué)院上海實驗室中心。將具有穩(wěn)定表達Vector和LINC01197的A549細胞皮下注射A549細胞懸液(每只裸鼠1×106個細胞)建立異種移植瘤模型(n=5)。接種3周后,測量腫瘤的長度和寬度估計腫瘤體積,并繪制腫瘤生長曲線。7周后切取腫瘤異種移植物并稱重。使用公式[(長×寬×寬)/2]計算腫瘤體積(mm3)。并通過qRT-PCR和免疫印跡檢測靶標基因表達。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1.在肺腺癌組織或細胞中觀察到LINC01197下調(diào)或Notch1上調(diào):圖1顯示,肺腺癌組織和細胞中LINC01197的表達下降,Notch1或Hes1的蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。

A～D:組織中LINC01197、Notch1和Hes1表達檢測,與癌旁組織比較,aP<0.05;E～H:組織中LINC01197、Notch1和Hes1表達檢測,與HBE比較,aP<0.05;與A549比較,bP<0.05

2.過表達LINC01197抑制肺腺癌細胞增殖、侵襲:圖2顯示,與Vector組比較,LINC01197組LINC01197表達上調(diào),Notch1和Hes1表達下調(diào),并且細胞活力、集落形成以及侵襲細胞數(shù)量均下調(diào)(P<0.05);與LINC01197組比較,LINC01197+Jagged-1/Fc組LINC01197表達無變化(P>0.05),Notch1和Hes1表達上調(diào),并且細胞活力、集落形成以及侵襲細胞數(shù)量均上調(diào)(P<0.05)。

A～D:各組LINC01197、Notch1和Hes1表達檢測;E～G:細胞增殖活力、集落形成數(shù)量以及侵襲細胞數(shù)量統(tǒng)計圖。與Vector組比較,aP<0.05;與LINC01197組比較,bP<0.05

3.LINC01197沉默促進肺腺癌細胞增殖、侵襲:圖3顯示,與sh-NC組比較,sh-LINC01197組LINC01197表達下調(diào),Notch1和Hes1表達上調(diào),并且細胞活力、集落形成以及侵襲細胞數(shù)量均上調(diào)(P<0.05);與sh-LINC01197組比較,sh-LINC01197+GSI組LINC01197表達無變化(P>0.05),Notch1和Hes1表達下調(diào),并且細胞活力、集落形成以及侵襲細胞數(shù)量均下調(diào)(P<0.05)。

A～D:各組LINC01197、Notch1和Hes1表達檢測;E～G:細胞增殖活力、集落形成數(shù)量以及侵襲細胞數(shù)量統(tǒng)計圖。與sh-NC組比較,aP<0.05;與sh-LINC01197組比較,bP<0.05

4.LINC01197過表達抑制體內(nèi)腫瘤生長:圖4顯示,與Vector組比較,LINC01197組腫瘤組織中LINC01197表達上調(diào),Notch1和Hes1表達下調(diào),并且腫瘤最大值的體積和大小均下調(diào)(P<0.05)。

A～C:各組腫瘤體積和重量檢測;D～G:各組LINC01197、Notch1和Hes1表達檢測。與Vector組比較,aP<0.05

討論

據(jù)報道,lncRNA在細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的基因表達在惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。盡管在肺腺癌中已鑒定出多種lncRNA,但肺腺癌的潛在致瘤性仍然未知。LINC01197位于15q26.2區(qū)域。目前關(guān)于LINC01197的研究較少。先前的研究證實,低表達LINC01197提示胰腺癌病人預(yù)后不良[11]。與之一致的是,本研究首次證明了LINC01197在肺腺癌中下調(diào)。進一步的功能研究揭示了LINC01197對肺腺癌細胞增殖、侵襲和腫瘤生長的負調(diào)控作用。提示其在肺腺癌腫瘤發(fā)生中具有腫瘤抑制作用。此外,Notch1和Hes1這兩個Notch信號分子在肺腺癌中同時表達上調(diào),提示LINC01197/Notch軸在肺腺癌的中可能存在相互作用機制。

Notch信號通路在各種癌癥類型中顯示出作為治療靶點的巨大前景[12]。一般來說,Notch信號通過配體-受體的相互作用釋放Notch胞內(nèi)域,進而正向調(diào)控其靶基因,如Split多毛增強子1(Hes1)[13]。Hes1被廣泛用作Notch激活的指標[14]。值得注意的是,Notch激活可以通過調(diào)節(jié)多種因素對細胞產(chǎn)生促增殖或抗增殖作用[15]。Liu等[16]研究顯示,Notch通路在人類肺腺癌發(fā)育中充當(dāng)腫瘤抑制因子。陳立松等[8]研究表明,Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可上調(diào)Notch1和Hes1進而對促進肺腺癌發(fā)揮促癌作用。同樣,本研究結(jié)果表明,在LINC01197介導(dǎo)的機制下,肺腺癌細胞中伴隨著Notch信號的激活。猜測Notch在肺腺癌發(fā)育過程中的激活可能還依賴于腫瘤分期或細胞環(huán)境,在多種調(diào)節(jié)機制下表現(xiàn)出適應(yīng)性作用。此外,加入Notch調(diào)節(jié)劑能逆轉(zhuǎn)LINC01197對肺腺癌細胞增殖、侵襲的負調(diào)控作用,提示Notch1在LINC01197誘導(dǎo)的抗增殖、抗侵襲作用中起關(guān)鍵作用。

總之,LINC01197在肺腺癌中可能通過調(diào)控Notch信號激活發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而,本研究并未直接探究肺腺癌中LINC01197對Notch信號通路是直接調(diào)控還是間接調(diào)控。由于Notch信號與各種癌癥進展調(diào)節(jié)因子之間存在復(fù)雜的串?dāng)_,仍需要更深入的研究來探索LINC01197功能障礙下Notch1介導(dǎo)的機制,以探索LINC01197靶向方法在肺腺癌中的治療價值。