滕青華

摘要：【目的】本試驗(yàn)通過(guò)研究玉米單作和間作對(duì)內(nèi)生菌的影響，為進(jìn)一步探明玉米黃草烏間作優(yōu)勢(shì)奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎门柙栽囼?yàn)，設(shè)A為玉米間作黃草烏根部尼龍網(wǎng)分隔（1株玉米+1株黃草烏）、B為玉米單作根部尼龍網(wǎng)分隔（1株玉米+1株玉米）及C為玉米與空白根部尼龍網(wǎng)分隔（CK，1株玉米+空白）?！窘Y(jié)果】玉米內(nèi)生細(xì)菌和真菌，A處理分別有12屬22株、11屬18株，B處理分別有8屬12株、9屬12株，C處理（CK）分別有5屬7株、5屬7株，3個(gè)處理玉米根、莖、葉中，A處理分別分離出9屬15株、7屬12株、8屬13株，B處理分離出6屬10株、6屬7株、5屬7株，C處理分離出5屬7株、3屬4株、2屬3株，A處理的內(nèi)生細(xì)菌和真菌均比B和C處理多；其中，有益內(nèi)生菌，A處理有6屬9株，B處理有5屬6株，C處理有2屬2株；總體上，A處理內(nèi)生菌數(shù)量最多、有益內(nèi)生菌也最多?！窘Y(jié)論】玉米與黃草烏間作增加了玉米內(nèi)生細(xì)菌和真菌的數(shù)量。

關(guān)鍵詞：玉米；黃草烏；間作；細(xì)菌和真菌

1 前言

植物內(nèi)生菌是重要的微生物資源，根莖葉等器官和組織細(xì)胞中都存在豐富的內(nèi)生菌[1]。內(nèi)生菌對(duì)宿主植物抵御病害有重要的作用[2]，因此，開發(fā)植物內(nèi)生菌生物防治的潛能已經(jīng)成為一項(xiàng)研究熱點(diǎn)，很多學(xué)者熱衷于分離對(duì)玉米常見病害有防控作用的菌株[3]，為開發(fā)生物農(nóng)藥等研究奠定基礎(chǔ)；內(nèi)生菌還可以促進(jìn)植物的養(yǎng)分吸收及生長(zhǎng)，傅曉方等人從玉米植株中篩選出固氮酶活性的內(nèi)生菌接種到小麥后，與未接種的比較，其小麥苗高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等都顯著提高[4]，韓曉日等人從玉米中分離出兩株具有固氮能力的菌株，能夠顯著地促進(jìn)幼苗期玉米的生長(zhǎng)[5-6]。但我們不清楚玉米與黃草烏間作根際互作對(duì)微生物群集有什么影響。為此，本文利用玉米與黃草烏間作，開展根際互作對(duì)玉米微生物內(nèi)生菌的研究，以期為更好地開發(fā)利用玉米促生菌及玉米黃草烏間作提高一定的依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 供試品種

玉米（Zea mays L.）：RD 26

黃草烏（Aconitum vilmorinianum Kom）：“滇草烏1號(hào)”。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

酒精、PCR試劑盒、1×TAE緩沖溶液、瓊脂糖、甘油、氯化鈉、酵母浸粉、胰蛋白胨、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)。設(shè)：A玉米間作黃草烏根部尼龍網(wǎng)分隔（1株黃草烏+1株玉米，種間）、B玉米單作根部尼龍網(wǎng)分隔（1株玉米+1株玉米，種內(nèi)）、C玉米根部與空白根部尼龍網(wǎng)分隔（1株玉米，CK）3個(gè)處理（見圖1），每盆為1次重復(fù)，重復(fù)16次，3（處理）×16（重復(fù)）=48盆；塑料盆大小為36 cm×30 cm，采用30μm網(wǎng)孔的尼龍網(wǎng)從上口徑到底部用對(duì)稱分為兩邊，以防止兩邊根系相互滲透。種植區(qū)域?yàn)榉叫?，面積為5.5m×7.8m。

2.3 田間種植及管理

玉米：玉米種子用0.5%次氯酸鈉消毒10min，然后用無(wú)菌水沖洗2～3次。

黃草烏：黃草烏塊根用多菌靈粉末殺菌消毒后直接種植。

土肥基質(zhì)質(zhì)量比例：土：蛭石：基質(zhì)：鋸木：有機(jī)肥=4：3：2：1：1

將經(jīng)過(guò)消毒殺菌處理的玉米種子與黃草烏塊根于2020年6月16日種下。在玉米與黃草烏生長(zhǎng)的每個(gè)階段都保證水肥充足，黃草烏對(duì)水分的需求要比玉米少，在保證水分充足的前提下，還要防止黃草烏滲水過(guò)多而造成根部腐爛，預(yù)防常見病蟲害，除雜草，測(cè)量生理指標(biāo)。

2.4 內(nèi)生菌篩選鑒定技術(shù)

2.4.1 培養(yǎng)基的配制方法

Luria-Bertani固體培養(yǎng)基（1000ml）：瓊脂15g，氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g。pH：7.2±0.2

Luria-Bertani液體培養(yǎng)基（1000ml）：氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g。pH：7.2±0.2

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱PDA（1000ml）：稱取39g。pH：5.6±0.2

培養(yǎng)基于121℃下滅菌20min，備用。

2.4.2 樣品處理

于玉米的灌漿期分別取A、B及C三處理玉米的根、莖、葉各三份，將取好的鮮材料保鮮后及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步進(jìn)行處理。用流動(dòng)的自來(lái)水洗滌玉米的根、莖和葉，然后用無(wú)菌蒸餾水洗滌，在超凈工作臺(tái)中用75％的乙醇表面消毒1min，用5%次氯酸鈉表面消毒5min，再用75％的乙醇表面消毒30s，最后在無(wú)菌蒸餾水中洗滌10min，總共洗3次，將最后的洗滌水鋪在Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，表面消毒方法的成功是通過(guò)在培養(yǎng)基中未檢測(cè)到微生物生長(zhǎng)來(lái)確認(rèn)的。篩選細(xì)菌的鮮材料需充分研磨，在Luria-Bertani液體培養(yǎng)基上充分震蕩24h，得到原液備用。篩選真菌的鮮材料切成適當(dāng)大小備用。

2.4.3 培養(yǎng)與純化

細(xì)菌培養(yǎng)需取上一步得到的原液500μL，加入4500μl的無(wú)菌水依次稀釋為10-2、10-3、10-4三個(gè)濃度，三個(gè)濃度分別涂布到Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，在恒溫箱中培養(yǎng)1～3d后，根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)、黏稠度、粗糙度等將可鑒定為不同的菌株分別接種到新的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，反復(fù)操作，直至分離出純化的菌株。真菌培養(yǎng)將切成適當(dāng)大小的鮮材料直接接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫箱培養(yǎng)2～10d，根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)、菌絲的有無(wú)、孢子的有無(wú)等將可鑒定為不同的菌株分別接種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，反復(fù)操作，直至分離出純化的菌株。

2.4.4 DNA提取

細(xì)菌DNA的提取步驟為從培養(yǎng)基上挑取1～2mg的菌落放入2.5ml的搖菌管，加入1000μl的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)24h備用，在PCR管中加入10μL的最佳伴侶和5μL菌液，95℃水浴裂解3min后12000rpm高速離心機(jī)上離心1～3min，吸取2μL上清液作為擴(kuò)增模板。真菌提取DNA步驟為從馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上取0.5～2mg菌落，加入12μl的bufferA，95℃水浴裂解10min后，在12000rpm高速離心機(jī)上離心5min，取2μL上清液作為擴(kuò)增模板。

2.4.5 PCR反應(yīng)體系

細(xì)菌反應(yīng)體系：酶（超光速mix）10μl，兩個(gè)引物1492R和27F各0.5μl，擴(kuò)增模板2μl，加入dd水7μl至反應(yīng)體系20μl。

真菌反應(yīng)體系：T5 Plant DNA Polymerase酶12μl，擴(kuò)增模板2μl，兩個(gè)引物ITS1、ITS4各0.5μl，加入dd水10μl至反應(yīng)體系25μl。

細(xì)菌引物序列為：

1492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’）

27 F（5’-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3’）

真菌引物序列為：

ITS1（5’-G GAAGGTAAAAGTCAAGG-3’）

ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）

反應(yīng)體系加完全后，進(jìn)行振蕩混勻，12000rpm高速離心機(jī)上離心1min。

2.5 測(cè)定指標(biāo)

生長(zhǎng)指標(biāo)：玉米株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉綠素含量、生物量、地上部分與地下部分重量。

產(chǎn)量指標(biāo)：玉米穗長(zhǎng)、穗粗以及籽粒干重。

3 結(jié)果與分析

3.1 玉米不同種植方式對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌的影響

不同處理情況下玉米根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，A處理根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)最多，共有7株，屬于堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬及寡養(yǎng)單胞菌屬5個(gè)屬；B處理共有4株，屬于寡養(yǎng)單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬及芽孢桿菌屬3個(gè)屬；C處理（CK）共4株，屬于寡養(yǎng)單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬及腸桿菌屬3個(gè)屬。說(shuō)明玉米間作黃草烏使玉米根內(nèi)生細(xì)菌增多。

不同處理玉米莖內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示，A處理共6株，屬于自沙門氏菌屬、腸桿菌屬及芽孢桿菌屬3個(gè)屬；B處理共3株，屬于腸桿菌屬等兩個(gè)2屬；C處理（CK）共1株，屬于腸桿菌屬。說(shuō)明單株種植使玉米莖內(nèi)生細(xì)菌種類減少，玉米間作黃草烏使玉米莖內(nèi)生細(xì)菌種類增多。

不同處理玉米葉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示，A處理共9株，屬于芽孢桿菌屬、勒克氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬5個(gè)屬；B處理共5株，屬于腸桿菌屬、假單胞菌屬及放射毛霉屬3個(gè)屬；C處理（CK）共2株，屬于副球菌屬。說(shuō)明玉米單作減少了玉米葉內(nèi)生細(xì)菌的種類，玉米間作黃草烏增加了玉米葉內(nèi)生細(xì)菌的種類。

3.2 玉米不同種植方式對(duì)其內(nèi)生真菌的影響

不同處理玉米根內(nèi)生真菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)，顯示，A處理共8株，屬于曲霉屬、木霉屬、鐮刀屬及擬莖點(diǎn)屬4個(gè)屬； B處理共6株，屬于鐮刀屬、木霉屬及曲霉屬3個(gè)屬；C處理（CK）共3株，屬于木霉屬和鐮刀屬2個(gè)屬。說(shuō)明單株種植減少了玉米根內(nèi)生真菌種類，玉米間作黃草烏使玉米根內(nèi)生真菌種類增多。

不同處理玉米莖內(nèi)生真菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)顯示，A處理共6株，屬于木霉屬、鐮刀屬、赤霉菌屬、籃狀菌屬4個(gè)屬；B處理共4株，屬于木霉屬、鐮刀屬、曲霉屬及擬莖點(diǎn)屬4個(gè)屬；C處理（CK）共3株，屬于鐮刀屬、曲霉屬2個(gè)屬。說(shuō)明單株種植減少了玉米莖內(nèi)生真菌的種類，玉米間作黃草烏增多了玉米莖內(nèi)生真菌種類。

不同處理玉米葉內(nèi)生真菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)顯示，A處理共4株，屬于擬莖點(diǎn)屬、鐮刀屬及曲霉屬3個(gè)屬；B處理共2株，屬于曲霉屬和木霉屬2個(gè)屬；C處理（CK）共1株，屬于赤霉菌屬。說(shuō)明單株種植減少了玉米葉內(nèi)生真菌種類，玉米間作黃草烏增加了玉米葉內(nèi)生真菌種類。

4 討論

研究表明玉米本身在根莖葉等組織器官中含有豐富的內(nèi)生菌，這些豐富的內(nèi)生菌有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)或者會(huì)釋放一些特殊的化學(xué)物質(zhì)[7]，是玉米抗病及增產(chǎn)的一個(gè)機(jī)制。內(nèi)生菌伴隨著植物的一生，在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，有益內(nèi)生菌的種類越豐富，則越有利于植物的生長(zhǎng)。因此，研究不同種植方式玉米內(nèi)生菌多樣性的變化情況，有利于找到對(duì)玉米抗病及增產(chǎn)有利的菌株。關(guān)于玉米內(nèi)生菌的研究已經(jīng)有了一個(gè)比較完備的結(jié)果，但是即使是同一品種的玉米，內(nèi)生菌的種類構(gòu)成也不是一成不變的，因?yàn)椴煌N植方式會(huì)對(duì)內(nèi)生菌的種類構(gòu)成產(chǎn)生影響。由A、B及C處理（CK）三種試驗(yàn)結(jié)果，玉米間作黃草烏與玉米單作及玉米單株種植相比增加了玉米內(nèi)生菌的數(shù)目。這與楊建波等人利用甘蔗及大豆間作，結(jié)果甘蔗莖內(nèi)生菌數(shù)量增加是一致的[8]。但有關(guān)玉米與黃草烏間作對(duì)內(nèi)生菌影響的研究

鮮有，因此，本研究還需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。由查閱文獻(xiàn)得，A處理中的促生菌及生防菌數(shù)量比B及C處理得都多，因此，本試驗(yàn)可能找到對(duì)玉米抗病、增產(chǎn)有益的菌株。但是玉米間作黃草烏模式是否可以固定的產(chǎn)生有益內(nèi)生菌株及是否有利于大田生產(chǎn)，還需要進(jìn)行進(jìn)一步及多次的試驗(yàn)。

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