田義恒,陳玉清

(1.江西科技師范大學 藥學院,江西 南昌 330038;2.河南省人民醫(yī)院 血液科,河南 鄭州 450000)

血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)也稱HO-1,是血紅素分解代謝過程中的限速酶,在全身組織廣泛存在,其可代謝血紅素產生一氧化碳、膽綠素和亞鐵,HMOX1及其酶產物在維持細胞穩(wěn)態(tài)和調節(jié)重要的生物過程中發(fā)揮重要作用,包括氧化應激、炎癥、細胞凋亡、細胞增殖、纖維化和血管生成[1]。HMOX1與多種癌細胞增殖密切相關,在多種腫瘤和組織中高表達,與腫瘤生長、浸潤、耐藥有關[2]。正常情況下,HMOX1可以保護機體,但對腫瘤組織來說,HMOX1可以增強腫瘤的抗殺傷能力,抑制腫瘤細胞死亡[3]。使用公共數據庫腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表達綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數據庫對HMOX1從基因表達、生存狀態(tài)、基因改變、蛋白磷酸化、免疫浸潤以及細胞的相關途徑進行基因表達、預后生存、免疫浸潤以及相關蛋白互作分析,有助于從臨床腫瘤樣本的角度理解HMOX1在腫瘤發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 利用TIMER2.0和UALCAN分析HMOX1在各癌癥中的表達在腫瘤免疫數據庫TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)“Gene-DE模塊”中輸入HMOX1,觀察不同腫瘤或特定腫瘤亞型下HMOX1在腫瘤與相鄰正常組織中的表達差異[4];對于某些無正常組織或者正常組織非常有限的腫瘤,使用GEPIA2(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫,選擇Expression DIY的“Box plot板塊”,設置P值為0.01,Log2FC為1,以及“匹配TCGA正常和GTEx數據”[5]。獲取這些腫瘤組織與基因型和基因表達量關聯(lián)(Genotype Tissue Expression,GTEx)數據庫中相應正常組織表達差異的箱線圖。UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)是用于分析癌癥組學數據的交互式網絡資源,通過使用臨床蛋白質組學腫瘤分析聯(lián)盟(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC)數據集進行蛋白表達分析[6]。選擇乳腺癌、卵巢癌、腎細胞癌、肺腺癌、子宮內膜癌、結腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺癌、多形膠質母細胞瘤、肝細胞癌等,分析HMOX1在10種原發(fā)腫瘤組織和正常組織蛋白中的表達情況。

1.2 利用基因表達譜在線分析平臺(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)2數據庫分析HMOX1在各癌癥中的生存預后使用GEPIA2中“Survival Map”模塊,獲取所有TCGA數據庫中表達HMOX1的腫瘤的總生存期(overall survival,OS)和無病生存期(disease-free survival,DFS)顯著性圖,設定臨界值-高、臨界值-低分別為50%、50%,初步探索HMOX1表達與腫瘤患者OS和DFS的關系。

1.3 利用腫瘤免疫浸潤評估資源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)2.0數據庫分析HMOX1在各癌癥中的免疫浸潤使用TIMER2.0數據庫中“Immune”模塊,輸入HMOX1并選擇癌癥相關成纖維細胞,研究TCGA不同癌癥類型中HMOX1表達與癌癥免疫浸潤的關系。應用TIDE、MCPCOUNTER、EPIC、EXCELL算法進行免疫浸潤評估。

1.4 利用STRING進行HMOX1相關蛋白互作分析利用STRING網站(https://cn.string-db.org/),輸入蛋白名稱HMOX1,物種選擇“Homo sapiens”,得到HMOX1的蛋白互作用網絡[7];使用GEPIA2網站獲取與HMOX1表達相關的前100個基因,并選取5個基因,使用GEPIA2工具的“Correlation Analysis”模塊分析這5個基因與HMOX1在各癌癥中表達的相關性,并利用TIMER2.0數據庫的“Gene_Corr”模塊將這 5個靶基因在各個癌癥中的表達以熱圖形式展示出來。此外,將前100個基因和蛋白互作的基因結合起來,并進行京都基因與基因組百科全書(kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。將基因列表上傳至DAVID,選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”和“Homo sapiens”,獲取功能注釋圖的數據,使用OmicShare(https://www.omicshare.com/)平臺繪制氣泡圖使KEGG富集通路可視化,使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,使生物學過程(biological process,BP)、細胞成分(cell components ,CC)和分子功能(molecular function,MF)數據可視化。

2 結果

2.1 基因表達分析HMOX1在TCGA數據庫多種癌癥中的表達:HMOX1在膀胱尿路上皮癌(bladder cancer,BLCA)、乳腺癌(breast carcinoma,BRCA)、食道癌(esophageal cancer,ESCA)、多形膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)、腎透明細胞癌(clear cell carcinoma of the kidney,KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(papillary cell carcinoma of the kidney,KIRP)、甲狀腺癌(thyroid cancer,THCA)和子宮內膜癌(endometrial cancer,UCEC)等癌癥組織中的表達均高于相應正常組織(P<0.05)(圖1A)。

使用GEPIA2數據庫將GTEx數據集的正常組織作為對照,進一步評估HMOX1在正常組織和各癌癥組織中的表達。HMOX1在GBM、KIRC、急性髓系細胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)、腦低級別膠質瘤(lower grade glioma,LGG)、胃癌(stomach cancer,STAD)、睪丸生殖細胞瘤(testicular cancer,TGCT)和子宮癌肉瘤(uterine carcinosarcoma,UCS)等癌癥組織中的表達高于相應正常組織,并且HMOX1在GBM和KIRC中呈高表達(P<0.05),與TIMER2.0分析結果一致(圖1B)。

運用UALCAN平臺中CPTAC數據集提供的蛋白質組數據評估HMOX1在腫瘤組織中的表達,結果顯示與正常組織相比,HMOX1在腎細胞癌(renal cell cancer,RCC)、UCEC、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)、胰腺癌(pancreatic cancer,PAAD)和GBM中的總蛋白表達高于正常組織(圖1C)。

2.2 生存分析使用GEPIA2網站,結合TCGA和GEO數據庫進行生存預后分析,結果顯示HMOX1高表達與LGG(P=0.025)和葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UVM)(P<0.05)的OS預后不良相關;DFS分析結果顯示,高表達HMOX1與前列腺癌(prostate cancer,PRAD)(P=0.013)、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)(P=0.001 1)和肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)(P=0.048)預后不良相關。此外,HMOX1低表達的KIRC(P=0.000 62)與OS預后不良相關,低表達HMOX1與膽管癌(bile duct cancer,CHOL)(P=0.007 9)和KIRC(P=0.001 1)的DFS預后不良相關。見圖2。

2.3 免疫浸潤分析應用TIDE、MCPCOUNTER、EPIC、EXCELL算法探索不同癌癥免疫浸潤水平與HMOX1表達的相關性,發(fā)現(xiàn)HMOX1表達與BLCA、結腸癌(colon cancer,COAD)、HNSC、LGG、PAAD、PRAD、STAD、TGCT、UCS的癌癥相關纖維細胞浸潤水平呈正相關(P<0.05)。見圖3。

A為HMOX1表達與BLCA、COAD、HNSC、LGG、PAAD、PRAD、STAD、TGCT、UCS的關系;B為HMOX1表達癌癥相關纖維細胞浸潤水平呈正相關(P<0.05)。

2.4 蛋白互作分析為進一步研究HMOX1在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的分子機制,篩選出HMOX1相互作用蛋白以及與HMOX1蛋白表達的相關基因,并對HMOX1表達相關基因進行富集分析。使用STRING數據庫獲取10個HMOX1結合蛋白,使用GEPIA2工具獲取HMOX1表達相關前100個基因,結果顯示HMOX1與LIPA(r=0.41)、DAB2(r=0.52)、ABI3(r=0.39)、CD4(r=0.32)和CD163(r=0.40)基因表達均呈正相關。相應熱圖數據顯示,HMOX1與上述5個基因在大部分癌癥中存在正相關。將兩組數據合并,通過DAVID網站進行KEGG和GO富集分析。KEGG數據表明,HMOX1在癌癥中發(fā)病機制可能與破骨細胞分化、卟啉和葉綠素代謝、金黃色葡萄球菌感染、TNF信號通路有關。GO富集分析進一步表明,這些基因與炎癥反應、細胞黏附有關,并且大多數基因編碼定位在質膜上,促使三磷酸鳥苷和蛋白結合。見圖4。

A為使用STRING數據庫獲取10個HMOX1結合蛋白;B為熱圖,數據顯示HMOX1與LIPA、DAB2、ABI3、CD4和CD163基因在大部分癌癥中呈正相關;C顯示HMOX1在癌癥中發(fā)病機制可能與破骨細胞分化、卟啉和葉綠素代謝、金黃色葡萄球菌感染、TNF信號通路有關;D為HMOX1與LIPA(r=0.41)、DAB2(r=0.52)、ABI3(r=0.39)、CD4(r=0.32)和CD163(r=0.40)基因表達均呈正相關。

3 討論

腫瘤浸潤性免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中與腫瘤起始、發(fā)展和轉移密切相關[8-9]。研究報道成纖維細胞促進腫瘤細胞生長、侵襲及免疫抑制,而且基因組穩(wěn)定不易耐藥,有望成為腫瘤免疫治療的新靶標[10]。HMOX1是一種催化血紅素在體內氧化降解的限速酶,廣泛存在于人體各器官中,其酶活性降低可以導致氧化應激降低、炎癥反應減弱和細胞凋亡率降低[11]。另外,HMOX1是血管內皮生長因子的有效誘導劑,而血管內皮生長因子是引起腫瘤血管新生的一種重要活化因子,可以促進內皮細胞增殖,從而使血管通透性增加,使細胞外基質對血管形成的誘導性生物學作用發(fā)生改變,并且高表達的HMOX1可以刺激癌細胞浸潤,導致血管生成、腫瘤轉移速度加快、血管通透性增加。在很多癌癥中,HMOX1被認為是一種重要的生存因子,研究表明HMOX1的過度表達可促使腫瘤細胞增殖、抵抗氧化應激、血管生成及病灶轉移[12],例如抑制卵巢癌細胞中HMOX1,可以抑制癌細胞增殖[13]。雖然有報道表明了腫瘤與HMOX1之間有聯(lián)系,但是HMOX1在不同腫瘤中的發(fā)病機制是否起到關鍵作用,通過怎樣的分子機制起作用還有待回答。

因此,本研究使用TCGA和GEO數據庫分析了數據庫中不同腫瘤類型,發(fā)現(xiàn)HMOX1在大多數腫瘤中高表達。研究表明HMOX1在膀胱癌、卵巢癌、食管鱗狀上皮細胞癌中的表達均高于相應的正常組織,發(fā)揮促進腫瘤增殖和遷移的作用[9,14-15]。但是預后生存分析表明HMOX1表達的高低在不同腫瘤中的預后有一定的差異性。DFS分析結果顯示,高表達HMOX1與PRAD、SKCM和LUAD預后不良相關。低表達KIRC與OS預后不良相關,低表達HMOX1與CHOL和KIRC的DFS預后不良相關。

腫瘤微環(huán)境主要由免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞、炎癥因子、細胞外基質以及癌細胞自身等共同組成,癌細胞的存活、生長、侵襲、遷移都受到周圍腫瘤微環(huán)境的影響。癌癥相關成纖維細胞作為腫瘤微環(huán)境中的主要成分之一,被認為是影響腫瘤微環(huán)境免疫調節(jié)的主要參與者,可通過多種途徑促進腫瘤的免疫逃逸[16],并且癌癥相關成纖維細胞在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮著多種作用,例如可以通過分泌促進癌細胞增殖、免疫排斥的生長因子和細胞外基質蛋白發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、轉移和侵襲作用,促進腫瘤耐藥,調節(jié)免疫細胞活性并抑制抗腫瘤免疫應答[17]。在原發(fā)性和轉移性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的癌癥相關成纖維細胞是高度通用的、可塑的和有彈性的細胞,它們通過與腫瘤微環(huán)境中其他細胞類型的復雜相互作用積極參與癌癥進展[18]。本研究主要分析了HMOX1表達與癌癥相關成纖維細胞浸潤水平之間的相關性,發(fā)現(xiàn)HMOX1表達與BLCA、COAD、HNSC、HPV-HNSC、LGG、PAAD、PRAD、STAD、TGCT、UCS的癌癥相關纖維細胞浸潤值呈正相關。

本研究對HMOX1靶向結合蛋白和HMOX1蛋白表達相關基因進行了一系列富集分析,結果顯示HMOX1在癌癥中發(fā)病機制可能和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、炎癥反應、細胞黏附有關。有研究表明TNF信號與塑造腫瘤微環(huán)境有關,并且在癌癥發(fā)展過程中,TNF有一定的抗癌作用,其途徑有誘導細胞凋亡、影響腫瘤血管系統(tǒng)和增強宿主免疫力3個方面。但是TNF對腫瘤的作用具備雙向性,既有抗瘤作用也具有促進腫瘤作用,其濃度非常關鍵,高濃度TNF-α可選擇性破壞腫瘤血管系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤效應,低濃度的TNF通過激活NF-κB信號通路,發(fā)揮抑制細胞凋亡和促進腫瘤增殖作用[19]。通過建立小鼠結腸癌肝轉移模型,研究TNF與HO-1與結腸癌發(fā)展之間關系,發(fā)現(xiàn)增加TNF水平,降低HO-1水平可以抑制腫瘤生長[20]。

綜上所述,本研究通過對HMOX1進行了全面的泛癌分析,發(fā)現(xiàn)HMOX1表達與多種人類癌癥的臨床預后、免疫浸潤等存在相關性,有助于從臨床腫瘤樣本的角度闡述HMOX1在腫瘤發(fā)生中的作用,為臨床診斷和治療提供依據與幫助。