郭慧,張化蓮,張?zhí)鹛?/p>

(駐馬店市中心醫(yī)院 產(chǎn)科,河南 駐馬店 463000)

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤,且起病隱匿,部分患者確診時已經(jīng)處于中晚期,給卵巢癌的治療帶來巨大挑戰(zhàn),順鉑(cisplatin,CDDP)是卵巢癌化療的常見藥物,其對卵巢癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有十分重要的作用[1]。近年來,卵巢癌CDDP耐藥已經(jīng)成為卵巢癌治療的難點(diǎn),通過分子靶向治療提高卵巢癌CDDP敏感性可能是提高卵巢癌患者預(yù)后的有效途徑。

miRNA是一類廣泛表達(dá)的小分子RNA,具有多種生物學(xué)效應(yīng)[2]。研究顯示,卵巢癌CDDP耐藥與miRNA有關(guān),miRNA在耐藥卵巢癌患者中表達(dá)改變,其參與調(diào)控卵巢癌CDDP敏感性[3]。miR-182-5p定位在7q32.2染色體上,參與調(diào)控聽力發(fā)育以及骨骼肌萎縮等過程[4]。大量研究顯示,miR-182-5p參與腫瘤進(jìn)展,miR-182-5p在胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中發(fā)揮類似抑癌基因的作用[5-6]。還有研究發(fā)現(xiàn),miR-182-5p在胃癌CDDP耐藥中發(fā)揮抑制作用[7]。既往研究表明,miR-182-5p可以降低卵巢癌細(xì)胞惡性生長和轉(zhuǎn)移能力[8]。目前對miR-182-5p在耐藥卵巢癌細(xì)胞中的作用以及其對卵巢癌CDDP耐藥性的作用還不明確。本研究以卵巢癌SKOV3細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象,探討miR-182-5p對卵巢癌細(xì)胞CDDP耐藥性的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自上海弘順生物公司;胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基購自深圳市百恩維生物公司;基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)抗體購自武漢艾美捷科技有限公司;CDDP購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;miR-182-5p mimics、mimics control、TRIM52過表達(dá)載體(pcDNA-TRIM52)、陰性對照載體(pcDNA)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建合成;C-Caspase-3抗體、三結(jié)構(gòu)域蛋白52(tripartite motif containing 52,TRIM52)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology;TRIM52-WT和TRIM52-MUT均由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 研究方法

1.2.1qRT-PCR檢測卵巢癌細(xì)胞中miR-182-5p水平 將對數(shù)生長期的SKOV3和CDDP處理的SKOV3細(xì)胞(SKOV3/CDDP)分別以1×106L-1的密度接種到6孔板中,培養(yǎng)24 h后,用Trizol試劑提取SKOV3和SKOV3/CDDP細(xì)胞中的總RNA,以紫外分光光度計檢測A260/280在1.8～2.0。配制逆轉(zhuǎn)錄體系,體系為2 μL 5×miScript RT Buffer、0.5 μL miScript RT Mix、7.5 μL RNase-Free water、1 μg總RNA,總體積為10 μL,在37 ℃孵育60 min,95 ℃孵育5 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為5 μL 2×QuantTect SYBR Green PCR Master Mix、0.5 μL miScript U6/miR-182-5p Primer、3.5 μL RNase-Free water、0.5μL cDNA,總體積為10 μL,反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃孵育15 s,94 ℃孵育15 s,58 ℃孵育20 s,72 ℃孵育20 s。以U6作為內(nèi)參,分析miR-182-5p水平。引物序列如下:miR-182-5p F 5’-TTAGGAACCCTCCTCTCTC-3’,R 5’-CGGTGATGTGAAGAAGGA-3’;U6F 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,R 5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將SKOV3細(xì)胞分成Control、miR-NC、miR-182-5p、miR-NC+CDDP、miR-182-5p+CDDP共5組,miR-NC、miR-NC+CDDP為轉(zhuǎn)染mimics control的SKOV3細(xì)胞,miR-182-5p、miR-182-5p+CDDP為轉(zhuǎn)染miR-182-5p mimic的SKOV3細(xì)胞,miR-NC+CDDP、miR-182-5p+CDDP在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12 h,更換為含有20 mg·L-1CDDP的細(xì)胞培養(yǎng)液,Control為正常培養(yǎng)的對照細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3MTT測定細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞按照Control、miR-NC、miR-182-5p、miR-NC+CDDP、miR-182-5p+CDDP分組方法接種到96孔板內(nèi)(每孔100 μL),調(diào)整細(xì)胞密度為3×104mL-1,培養(yǎng)24 h,在每個孔中添加10 μL MTT溶液,37 ℃孵育4 h。棄上清,添加150 μL二甲基亞砜溶液,反應(yīng)10 min,酶標(biāo)儀測定490 nm的A值。A值表示細(xì)胞增殖能力。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞,用胰蛋白酶將細(xì)胞消化,PBS洗滌細(xì)胞2次,加入結(jié)合緩沖液500 μL,添加5 μL Annexin V-FITC和PI染液,孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前用Matrigel將小室濕化,用8 μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。將SKOV3細(xì)胞按照分組方法以不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將密度調(diào)整為1×106mL-1,在小室中添加200 μL的細(xì)胞懸浮液,在下室中添加600 μL的含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,用PBS洗滌小室,添加95%的乙醇溶液處理5 min,然后用0.5%的結(jié)晶紫溶液染色10 min,用PBS洗滌。用棉簽將沒有穿膜的細(xì)胞擦掉,在顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜數(shù)量即為細(xì)胞侵襲或遷移數(shù)目。

1.2.6Western blot檢測MMP-9、C-Caspase-3蛋白水平 收集各組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞,在細(xì)胞中添加RIPA裂解溶液,放在冰上靜置30 min,4 ℃、12 000g離心10 min。棄去沉淀,吸取上清,用BCA方法測定蛋白樣品的濃度。在蛋白樣品中添加5×Loading Buffer溶液充分混合,100 ℃煮沸5 min。分別制備100 g·L-1的分離膠和50 g·L-1的濃縮膠,在每個上樣孔內(nèi)添加30 μg的蛋白樣品,以80 V的電壓電泳30 min,再調(diào)整電壓為120 V,繼續(xù)電泳2 h。裁剪合適大小的PVDF膜,浸泡在甲醇中,然后放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min。設(shè)置200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。把PVDF膜放在50 g·L-1牛血清白蛋白封閉液中孵育結(jié)合2 h,然后放在一抗稀釋液中浸泡2 h,最后放在二抗稀釋液中浸泡2 h。用ECL顯色試劑盒顯色。內(nèi)參為GAPDH,分析目的蛋白表達(dá)變化。二抗以1∶4 000稀釋,MMP-9、C-Caspase-3一抗分別以1∶1 000和1∶600稀釋。

1.2.7靶基因預(yù)測和鑒定 用在線生物學(xué)軟件targetscan預(yù)測靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-182-5p和TRIM52 3’UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。利用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系。將TRIM52-WT和TRIM52-MUT分別與miR-182-5p mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染到SKOV3/CDDP細(xì)胞中,培養(yǎng)24 h后,用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性變化。TRIM52-WT為含有TRIM52 3’UTR端結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報告載體,TRIM52-MUT為含有突變以后TRIM52 3’UTR端結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報告載體。收集培養(yǎng)24 h后的Control、miR-NC、miR-182-5p組細(xì)胞,用Western blot方法測定細(xì)胞中TRIM52蛋白表達(dá)變化,步驟同1.7,TRIM52一抗以1∶1 200稀釋。

1.2.8TRIM52過表達(dá)載體對miR-182-5p聯(lián)合CDDP影響SKOV3/CDDP細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用 SKOV3細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染陰性對照載體、miR-182-5p mimics和TRIM52過表達(dá)載體、miR-182-5p mimics,然后用含有20 mg·L-1CDDP的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),分別記為miR-182-5p+CDDP+Vector、miR-182-5p+CDDP+TRIM52組,細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后,MTT方法測定增殖(步驟同1.4),流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡(步驟同1.5),Transwell小室測定遷移和侵襲(步驟同1.6),Western blot測定MMP-9、C-Caspase-3、TRIM52蛋白表達(dá)(步驟同1.7),結(jié)果比較以miR-182-5p+CDDP+Vector組作為參照。

2 結(jié)果

2.1 miR-182-5p在SKOV3/CDDP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)SKOV3/CDDP細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)(0.63±0.07)低于SKOV3細(xì)胞(1.00±0.12)(t=7.990,P<0.001),miR-182-5p在SKOV3/CDDP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

2.2 miR-182-5p mimics聯(lián)合CDDP對SKOV3/CDDP細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移影響轉(zhuǎn)染miR-182-5p mimics和CDDP處理后的SKOV3/CDDP細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力降低,凋亡率升高,MMP-9蛋白水平降低,C-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.001),見圖1和表1。

A為流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-182-5p mimics和CDDP處理后SKOV3/CDDP細(xì)胞凋亡變化;B為Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-182-5p mimics和CDDP處理后SKOV3/CDDP細(xì)胞中MMP-9、C-Caspase-3蛋白表達(dá)情況。

表1 5組SKOV3細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)水平及對增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響

2.3 miR-182-5p和TRIM52互為靶向關(guān)系在線靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-182-5p和TRIM52 3’UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,WT和miR-182-5p mimics共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性下降(P<0.001),見圖2和表2。miR-182-5p和TRIM52互為靶向關(guān)系。

圖2 在線靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-182-5p和TRIM52 3’UTR端結(jié)合位點(diǎn)

表2 熒光素酶活性

2.4 上調(diào)miR-182-5p抑制SKOV3/CDDP細(xì)胞中TRIM52蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染miR-182-5p mimics后的SKOV3/CDDP細(xì)胞中TRIM52蛋白表達(dá)下降(P<0.001),見圖3和表3。上調(diào)miR-182-5p可抑制SKOV3/CDDP細(xì)胞中TRIM52蛋白表達(dá)。

圖3 SKOV3/CDDP細(xì)胞中TRIM52蛋白表達(dá)情況

表3 轉(zhuǎn)染miR-182-5p mimics后SKOV3/CDDP細(xì)胞中TRIM52蛋白表達(dá)

2.5 TRIM52逆轉(zhuǎn)miR-182-5p聯(lián)合CDDP對SKOV3/CDDP細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡作用與共轉(zhuǎn)染陰性對照載體和miR-182-5p mimics比較,共轉(zhuǎn)染TRIM52過表達(dá)載體和miR-182-5p mimics后的SKOV3/CDDP細(xì)胞經(jīng)過CDDP處理以后,細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力升高,細(xì)胞凋亡率下降,細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)水平增多,C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平減少(P<0.001),見圖4和表4。TRIM52逆轉(zhuǎn)miR-182-5p聯(lián)合CDDP對SKOV3/CDDP細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡作用。

A為流式細(xì)胞儀檢測SKOV3/CDDP細(xì)胞凋亡變化;B為Western blot檢測SKOV3/CDDP細(xì)胞中TRIM52、MMP-9、C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

表4 共轉(zhuǎn)染TRIM52過表達(dá)載體和miR-182-5p mimics經(jīng)CDDP處理后SKOV3/CDDP細(xì)胞A值、凋亡率、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和MMP-9、C-Caspase-3、TRIM52蛋白表達(dá)水平

3 討論

miRNA在真核生物體內(nèi)普遍存在,其無開放閱讀框,因此幾乎無編碼蛋白質(zhì)的功能。miRNA在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。miRNA不僅與機(jī)體正常的生理過程有關(guān),還與疾病發(fā)生和進(jìn)展關(guān)系密切,已知miRNA與關(guān)節(jié)炎、膿毒癥、糖尿病等多種疾病的惡性進(jìn)展有關(guān),miRNA有望成為疾病治療的分子靶點(diǎn)[10]。近些年來,miRNA與腫瘤的關(guān)系引起人們廣泛關(guān)注,miRNA在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程中扮演重要角色[11]。miR-182-5p在人體組織中表達(dá),具有多種生物學(xué)作用,其參與腫瘤進(jìn)展,并且在不同的腫瘤組織中發(fā)揮作用不同,在乳腺癌、結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)miR-182-5p可以抑制腫瘤進(jìn)展,而在口腔鱗狀細(xì)胞癌、白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-182-5p可以抑制腫瘤細(xì)胞生長[5-6,12-13]。研究發(fā)現(xiàn),miR-182-5p在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào),miR-182-5p具有抑制卵巢癌細(xì)胞生長的作用[8]。miR-182-5p參與腫瘤CDDP耐藥,miR-182-5p可提高胃癌細(xì)胞CDDP敏感性[7]。本研究結(jié)果顯示,miR-182-5p在耐藥卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),并且miR-182-5p聯(lián)合CDDP抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,miR-182-5p具有提高卵巢癌CDDP敏感性的作用,這與之前的報道相一致,均說明miR-182-5p參與腫瘤耐藥發(fā)生。

本研究還發(fā)現(xiàn),miR-182-5p聯(lián)合CDDP可降低耐藥卵巢癌細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá),提高C-Caspase-3蛋白表達(dá)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一,其具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用,在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮癌基因的作用,其表達(dá)越高,腫瘤轉(zhuǎn)移能力也就越強(qiáng)[14]。C-Caspase-3是經(jīng)過剪切活化以后的Caspase-3,Caspase-3是Caspase蛋白家族成員,是細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)控因子,Caspase-3位于凋亡反應(yīng)的下游,其活化后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,miR-182-5p聯(lián)合CDDP誘導(dǎo)耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移,這與細(xì)胞凋亡和遷移、侵襲檢測結(jié)果一致。

miRNA發(fā)揮生物學(xué)作用與調(diào)控靶基因的表達(dá)有關(guān),這也是miRNA功能多樣的重要原因[16]。miRNA與靶mRNA的3’UTR端通過堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合,并且同一個miRNA能夠與多個目標(biāo)mRNA結(jié)合,同一個目標(biāo)mRNA也可以受到多個miRNA的調(diào)控作用,miRNA通過這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與多種病理和生理過程[17-19]。本實(shí)驗(yàn)表明,miR-182-5p靶向抑制TRIM52表達(dá)。TRIM52位于5q35.3染色體上,其是TRIM家族成員之一,參與腫瘤進(jìn)展[20]。TRIM52在肝癌、卵巢癌等腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)作用,其可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)TRIM52可以逆轉(zhuǎn)miR-182-5p聯(lián)合CDDP對耐藥卵巢癌細(xì)胞生長、侵襲、遷移和凋亡的作用,提示miR-182-5p靶向TRIM52影響卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性。

綜上,miR-182-5p在卵巢癌CDDP耐藥中可能發(fā)揮抑制作用,其可以靶向TRIM52提高卵巢癌CDDP敏感性,這為提高卵巢癌CDDP敏感性提供了新方向,為研究卵巢癌CDDP耐藥發(fā)生機(jī)制提供了理論數(shù)據(jù)。