裴懷弟，宿兵兵，李玉斌，李淑潔，王立光，李琦，劉新星

摘要：為了給人參果病毒檢驗(yàn)及抗病性研究提供支持，對(duì)人參果采用ELISA和RT-PCR兩種檢測(cè)方法對(duì)8份田間材料中的馬鈴薯M病毒（PVM）、番茄花葉病毒（ToMV）和煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比篩選病毒檢測(cè)方法。結(jié)果表明，ELISA法檢測(cè)PVM的陽(yáng)性檢出率為87.5%；ToMV為37.5%，疑似率為12.5%；TMV為37.5%。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)體系，從人參果樣品中分別擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的特異條帶，PVM陽(yáng)性檢出率為100%，ToMV為 50.0%，TMV為37.5%，檢測(cè)靈敏性和準(zhǔn)確性更高，檢測(cè)結(jié)果符合率在87.5%以上。對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收測(cè)序，確定為目標(biāo)條帶。

關(guān)鍵詞：人參果；病毒；ELISA檢測(cè)；RT-PCR檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S662.5? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2023）04-0365-04

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.04.016

Study on the Detection Methods for Main Viruses of Ginseng Fruit

PEI Huaidi 1， SU Bingbin 1， 2， LI Yubin 3， LI Shujie 1， WANG Liguang 1， LI Qi 1， LIU Xinxing 1

（1. Biotechnology Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. School of Environmental

and Municipal Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Institute of Fruit and Floriculture Research， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： To provide references for virus testing and disease resistance research in ginseng fruit （Solanum muricatum Aiton），8 materials of ginseng fruit were tested from the fields by using ELISA and RT-PCR methods to detect potato virus M（PVM）， tomato mosaic virus （ToMV） and tobacco mosaic virus （TMV）， and comparison and screening of virus detection methods were conducted. The results showed that by using the ELISA method， the positive detection rates of PVM and ToMV were 87.5% and 37.5%， respectively，suspicion rate was 12.5%， and the positive rate of TVM was 37.5%. By using the RT-PCR detection system， specific bands were amplified from ginseng fruit samples which were consistent with the size of the test design， the positive detection rates of PVM， ToMV and TMV were 100%， 50.0% and 37.5%， respectively， which indicated better detection sensitivity and accuracy， the coincident rate of the detected results was more than 87.5%. The amplified positive product was sequenced by gel recovery and was identified as the target band.

Key words： Solanum muricatum Aiton; Virus; ELISA test; RT-PCR test

人參果（Solanum muricatum Ait.）又名香瓜茄、長(zhǎng)壽果、鳳果等，為茄科茄屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈北麓［1 - 2 ］，自20世紀(jì)80年代引入中國(guó)，在我國(guó)多地均有種植。生產(chǎn)過(guò)程中人參果通常采用扦插繁殖育苗，長(zhǎng)期無(wú)性繁殖造成人參果病毒病的感染和蔓延，主要表現(xiàn)為植株矮化、節(jié)間變短、葉片皺縮呈黃綠相嵌的斑駁狀、果實(shí)僵化畸形等，對(duì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)影響巨大。培育無(wú)病毒種苗是預(yù)防病毒病的有效措施，同時(shí)對(duì)病毒的防控、無(wú)毒苗生產(chǎn)及海關(guān)檢疫等方面顯得尤為必要［3 ］。目前，關(guān)于人參果的研究主要集中在組培快繁［4 - 7 ］、溫室栽培 及基因組學(xué)等方面［8 - 13 ］，而關(guān)于病毒的種類、鑒定及高效檢測(cè)研究相對(duì)較少。我們采用雙抗體夾心ELISA和RT-PCR兩種檢測(cè)方法，對(duì)人參果植株主要病毒進(jìn)行分析，以期為人參果病毒檢驗(yàn)及抗病性研究提供支持。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試材料為人參果組培苗，共8份，培養(yǎng)材料為人參果側(cè)芽，采自甘肅省武威市民勤縣雙茨科鎮(zhèn)農(nóng)戶溫室大棚，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所培育并提供，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為化學(xué)分析純。

1.2? ?試驗(yàn)方法

將大田采集的人參果側(cè)芽用流水沖洗3～4 h，控干水分，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水洗3～5遍，用70%乙醇消毒30～40 s，投入1 g/kg升汞溶液中消毒5～6 min，再用無(wú)菌水洗5～6次，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中晾干水分后接種于MS培養(yǎng)基（添加30 g/L蔗糖）中，pH為5.8～6.0。在溫度（25±2） ℃、光照12～16 h，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx條件下培養(yǎng)，每隔25 d左右進(jìn)行轉(zhuǎn)接，獲得無(wú)菌苗備用。

1.2.1? ? 引物的設(shè)計(jì)? ? 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上已公布的PVM 、TMV、ToMV的RNA序列，對(duì)PVM（NC_001361.2）、ToMV（NC_002692.1）和TMV（NC_ 001367.1）序列進(jìn)行BLAST（basic local alignment search tool）相似性比較，找出3種病毒RNA的高度特異性區(qū)域，設(shè)計(jì)試驗(yàn)所用引物。所用引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

1.2.2? ? RNA提取? ? 采用TIAN GEN RNAprep pure Plant Kit（DP432）提取人參果葉片總RNA。取50～100 mg植物葉片，在液氮中迅速研磨成粉，加入450 μL裂解液RL，旋渦劇烈震蕩混勻。其他步驟按說(shuō)明書操作。將提取的總RNA溶解于50 μL的ddH2O中備用。

1.2.3? ? RT-PCR檢測(cè)? ? 采用TIAN GEN FastKinggDNA Dispelling RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR118- 02），以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，然后在MiniAmp Thermal Cycler儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為將cDNA 1 μL加入14 μLRT-PCR反應(yīng)液中，混勻后放入儀器中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4? ? RT-PCR產(chǎn)物回收與測(cè)序? ? 取擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，各條帶充分分離時(shí)切取膠進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物純化步驟按TIANgel Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，回收產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5? ? 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)? ? 取0.2 g人參果葉片置于研缽中，加1.5 mL提取緩沖液，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，搖勻；4 ℃、12 000 r/min下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測(cè)所用試劑盒購(gòu)自Agdia公司（產(chǎn)品編號(hào)：PSA60000），測(cè)定方法按抗體說(shuō)明書進(jìn)行。在試驗(yàn)條件恒定的情況下，利用標(biāo)本/陰性對(duì)照的比值進(jìn)行分析。根據(jù)測(cè)定所得的吸光度求出被測(cè)樣品光密度值（P）與標(biāo)樣（健康材料）光密度值（N）比值（P/N）。結(jié)果判定：P/N＜1.50者，為陰性（不帶毒材料）；P/N介于1.50～1.99者，為疑似（輕度帶毒材料）；P/N≥2.00者，為陽(yáng)性（帶毒材料）。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?ELISA檢測(cè)

利用雙抗體夾心ELISA 對(duì)人參果主要病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表2）表明，人參果中含有馬鈴薯M病毒（PVM）、番茄花葉病毒（ToMV）和煙草花葉病毒（TMV）病毒。檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，PVM的陽(yáng)性檢出率為87.5%；ToMV的陽(yáng)性檢出率為37.5%，疑似率為12.5%；TMV的陽(yáng)性檢出率為37.5%。上述結(jié)果表明，田間種植的人參果中普遍含有馬鈴薯M病毒，為最主要病毒，其次為番茄花葉病毒和煙草花葉病毒。

2.2? ?RT-PCR檢測(cè)

以人參果總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，3種病毒的感病植株在瓊脂糖凝膠上分別呈現(xiàn)出與目標(biāo)片段大小相一致的反應(yīng)譜帶。如圖1所示，擴(kuò)增后得到了分子量分別為261 bp（PVM）、365 bp（ToMV）、 343 bp（TMV）的片段，且該片段與理論設(shè)計(jì)長(zhǎng)度相一致。測(cè)定結(jié)果表明，PVM的陽(yáng)性檢出率為100%。ToMV的陽(yáng)性檢出率為50.0%，TMV的陽(yáng)性檢出率為37.5%。

2.3? ?基因序列同源性比對(duì)

隨機(jī)抽取人參果3種病毒cDNA擴(kuò)增檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本各3份進(jìn)行凝膠回收純化，對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（圖2）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)與NCBI報(bào)道的3種病毒的基因序列相比同源性很高，陽(yáng)性標(biāo)本基因序列比對(duì)結(jié)果：PVM同源性為94.25%，ToMV為100%，TMV為81.34%，說(shuō)明3種病毒引物在人參果中所提取的RNA中擴(kuò)增出的基因片段為PVM、ToMV和TMV的目標(biāo)片段。

2.4? ?兩種檢測(cè)方法對(duì)比

對(duì)8份人參果材料用兩種方法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果（表3）表明，2種檢測(cè)方法有較高的符合率，RT-PCR檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性更高，ELISA檢測(cè)為疑似的植株通過(guò)RT-PCR檢測(cè)則為陽(yáng)性，避免了假陰性的出現(xiàn)，檢測(cè)靈敏性更高。二者檢測(cè)符合率在87.5%以上。

3? ?討論與結(jié)論

植物病毒檢測(cè)常用的方法中有生物學(xué)、電子顯微觀察法、血清學(xué)和分子生物學(xué)等［14 - 15 ］，實(shí)際操作中多采用兩種以上方法相結(jié)合來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定方便、靈敏度較高，但只能檢測(cè)到納克水平的病毒，難于檢測(cè)更低濃度的病毒［16 ］；聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）是分子生物學(xué)中最常見(jiàn)的檢測(cè)方法之一，通過(guò)體外擴(kuò)增的方法對(duì)供試樣品中的目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，從而對(duì)即使病毒含量極低的樣品也能靈敏準(zhǔn)確地得到定性的檢測(cè)結(jié)果，其靈敏度和特異性較高，是一種較好的植物病毒檢測(cè)方法［17 ］。

本試驗(yàn)采用兩種方法檢測(cè)的結(jié)果表明，田間種植的人參果普遍含有馬鈴薯M病毒，為最主要的病毒，其次為番茄花葉病毒和煙草花葉病毒。ELISA檢測(cè)中PVM的陽(yáng)性檢出率為87.5%；ToMV為37.5%，疑似率為12.5%；TMV為37.5%。試驗(yàn)建立的RT-PCR檢測(cè)體系，從人參果樣品中分別擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的特異條帶，結(jié)果顯示，PVM陽(yáng)性檢出率為100%，ToMV為 50.0%，TMV為37.5%，這在基因水平上為馬鈴薯M病毒、番茄花葉病毒和煙草花葉病毒的檢測(cè)提供了更快速、靈敏檢測(cè)手段，避免了假陰性的出現(xiàn)，且檢測(cè)結(jié)果符合率在87.5%以上。

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