徐洪超,商 靖,呂 鑫,逄洪波,王蘭蘭,李雪梅,馬蓮菊, 王艷秋,李玥瑩

(1.沈陽師范大學生命科學學院,遼寧沈陽 110034; 2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學院高梁研究所,遼寧沈陽 110161)

高粱是當今世界上的主要糧食作物之一,是一種產(chǎn)量高、抗逆性強、適應性廣的C4植物[1]。根據(jù)用途不同高粱可以分為粒用高粱、糖用高粱(甜高粱)、帚用高粱、飼用高粱4種類型。高粱還可以作為釀酒、釀醋和制糖的原料[2]。由于需求的增加,高粱的種植面積呈現(xiàn)上升的趨勢,但很難達到像水稻、玉米種植規(guī)模的水平[3]。因此,如何提高高粱的產(chǎn)量,是目前科研工作者所需要研究的問題。碳代謝是植物最基礎的生理代謝過程[4],碳代謝可以通過協(xié)調(diào)多種相關酶來影響植物的生長發(fā)育,對植物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成過程具有重要意義。

碳代謝過程涉及多種相關酶,包括蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADPG-ppase)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDPG-ppase)等關鍵酶。SS作為植物蔗糖代謝過程的關鍵酶,可以催化蔗糖的分解與合成。SS不僅與植物產(chǎn)量、品質(zhì)、淀粉含量相關,還在植物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[5]。目前已經(jīng)在高粱[6]、小麥[7]等多種植物體中克隆到了SS基因,并轉(zhuǎn)化到其他植物中,蔗糖含量、光照等因素均可以影響SS基因的表達。前人研究發(fā)現(xiàn),高粱葉片中SS、SPS活性與可溶性總糖含量呈極顯著正相關關系,說明它們對高粱的糖積累過程具有重要意義[8]。SPS是調(diào)控蔗糖合成的關鍵酶之一,廣泛存在于葉片、塊莖、果實等組織中,除了在植物生長發(fā)育中發(fā)揮作用,在面對干旱、低溫等脅迫時作出響應[9],SPS還可以調(diào)節(jié)碳分配。Hashida等研究表明,對水稻SPS基因進行敲除,會降低葉片中SPS活性,從而影響淀粉和蔗糖的比例[10]。SPS基因最早在玉米中被分離出來[11],甜菜[12]、枸杞[13]等物種中均相繼克隆出SPS基因。光照、溫度等外界因素都可以影響SPS基因的表達。SSS通常存在于可溶性基質(zhì)中,在玉米胚乳中已經(jīng)分離出4種類型SSS(zSSI、zSSIIa、zSSIIb 和 zSSIII),催化支鏈淀粉的合成[14]。曲瑩等研究發(fā)現(xiàn),SSS活性與淀粉含量分配的關系因生長發(fā)育的進程不同而不同[15]。溫度、光照、CO2濃度等因素都能影響SSS的活性。ADPG-ppase、UDPG-ppase是淀粉合成過程中的關鍵酶[16]。依兵研究發(fā)現(xiàn),ADPG-ppase、UDPG-ppase不僅可以催化直鏈淀粉的積累,還能調(diào)節(jié)支鏈淀粉的合成[17]。

本研究以遼粘3號、遼糯12號、遼雜11號和遼雜53號4個高粱品種為試驗材料,分別測定高粱的碳代謝相關酶活性,用熒光定量PCR技術分析SPS基因的表達情況,從生理和基因的角度為篩選優(yōu)質(zhì)高粱品種提供理論依據(jù)與指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料是由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院高粱研究所提供的遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號4個高粱品種。試驗采取多因素隨機區(qū)組設計,行長6 m,行寬0.55 m,4行區(qū),3次重復,氮肥用量為180 kg/hm2,磷、鉀肥用量均為75 kg/hm2。

1.2 試驗方法

1.2.1 碳代謝相關酶活性測定 試驗于2021年在遼寧省農(nóng)業(yè)科學院進行。在苗期(6月初)、拔節(jié)期(6月末7月初)、抽穗期(7月末)、成熟期(9月中下旬)4個高梁生長時期,分別隨機選取遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號高粱植株的倒二葉和頂端的籽粒(抽穗期和成熟期),放入液氮速凍,迅速帶回實驗室于-80 ℃冰箱保存,用來測定碳代謝關鍵酶活性以及SPS基因的相對表達量。

SS、SPS活性的測定方法:按照張志良等的方法[18]提取粗酶液,在反應體系中依次加入0.1 mL Hepes-NaOH緩沖液、0.04 mL MgCl2、0.04 mL UDPG、0.04 mL果糖溶液、0.1 mL酶提取液進行SS活性的測定;SPS活性測定可與SS活性測定同時進行,只需將SS反應體系中的果糖溶液換成6-磷酸果糖溶液,其余試劑用量操作均與上述一致。

SSS、ADPG-ppase、UDPG-ppase的活性采用江蘇寶萊公司的ELISA試劑盒檢測,具體方法參照說明書。

1.2.2SPS基因表達量測定

1.2.2.1 總RNA的抽提 本過程所用試劑及其操作步驟均由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.2.2.2 反轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄反應體系見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應體系

逆轉(zhuǎn)錄程序設置:第1階段25 ℃,5 min;第2階段42 ℃,30 min;第3階段85 ℃,5 s。

1.2.2.3 RT-qPCR反應 PCR反應體系:2× qPCR Mix 7.5 μL,2.5 μmol/L基因引物(上游+下游)1.5 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)2.0 μL,ddH2O 4.0 μL。反應條件:第1階段95 ℃預變性10 min;第2階段95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸30 s,40個循環(huán)?；虮磉_分析特異性引物見表2。

表2 基因表達分析特異性引物

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析,使用Origin 2021軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同時期不同品種高粱SS活性比較分析

2.1.1 不同時期不同品種高粱葉片中SS活性比較分析 由圖1可知,在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期4個時期內(nèi),葉片中SS活性整體呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢,苗期和拔節(jié)期的SS活性變化不大,拔節(jié)期達到最低值,成熟期高粱葉片SS活性遠遠高于苗期和拔節(jié)期。遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號成熟期高粱葉片SS活性分別是苗期的5.30倍、3.25倍、3.13倍、3.78倍。

苗期和拔節(jié)期遼糯12號高粱葉片SS活性最高,遼粘3號次之;抽穗期和成熟期遼粘3號高粱葉片SS活性均顯著高于其他3個高粱品種(P<0.05),抽穗期遼粘3號SS活性分別是遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號的2.23倍、1.75倍、2.28倍;成熟期遼粘3號SS活性分別是遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號的2.12倍、1.41倍、1.89倍。

2.1.2 不同時期不同品種高粱籽粒中SS活性比較分析 由圖2可知,成熟期高粱籽粒SS活性要高于抽穗期,遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號成熟期高粱籽粒SS活性分別是抽穗期的2.05倍、1.66倍、1.52倍、4.64倍。抽穗期高粱籽粒SS活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號,其中遼粘3號和遼糯12號差異不顯著;成熟期高粱籽粒SS活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼雜53號>遼糯12號>遼雜11號,遼粘3號顯著高于其他品種(P<0.05),分別比遼雜53號、遼糯12號、遼雜11號提高了9.01%、36.83%、40.58%。

2.2 不同時期不同品種高粱SPS活性比較分析

2.2.1 不同時期不同品種高粱葉片中SPS活性比較分析 由圖3可知,在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期4個時期,高粱葉片SPS活性呈先降后升的變化趨勢,拔節(jié)期活性最低,成熟期活性最高,這與SS活性的變化趨勢基本一致。遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號成熟期高粱葉片SPS活性分別是苗期的5.09倍、3.32倍、3.12倍、2.87倍。

苗期高粱葉片SPS活性表現(xiàn)為遼糯12號>遼粘3號>遼雜53號>遼雜11號;抽穗期高粱葉片SPS活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜53號>遼雜11號,遼粘3號顯著高于其他3個品種;成熟期遼粘3號高粱葉片SPS活性也顯著高于其他3個品種(P<0.05),分別是遼糯12號、遼雜53號、遼雜11號的1.37倍、2.12倍、2.03倍。

2.2.2 不同時期不同品種高粱籽粒中SPS活性比較分析 由圖4可知,成熟期高粱籽粒SPS活性明顯高于抽穗期,成熟期遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號高粱籽粒的SPS活性分別是抽穗期的2.26倍、1.41倍、1.35倍、2.66倍。抽穗期遼糯12號高粱籽粒SPS活性最高,遼粘3號次之;成熟期高粱籽粒SPS活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼雜53號>遼糯12號>遼雜11號,遼粘3號高粱籽粒SPS活性分別比遼雜53號、遼糯12號、遼雜11號提高了26.26%、57.22%、75.81%。

2.3 不同時期不同品種高粱SSS活性比較分析

2.3.1 不同時期不同品種高粱葉片中SSS活性比較分析 由圖5可知,在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期4個時期內(nèi),遼粘3號和遼雜11號高粱葉片SSS活性呈先降后升的趨勢;遼糯12號和遼雜53號呈先升再降再升的變化趨勢,但4個品種的SSS活性均在成熟期達到最高。成熟期遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號高粱葉片SSS活性分別是苗期的1.80倍、1.41倍、1.64倍、1.11倍。

苗期,高粱葉片SSS活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼雜11號>遼糯12號>遼雜53號,遼粘3號SSS活性顯著高于其他3個品種;拔節(jié)期,高粱葉片SSS活性表現(xiàn)為遼糯12號>遼粘3號>遼雜53號>遼雜11號,遼糯12號和遼粘3號之間差異不顯著;抽穗期和成熟期遼粘3號高粱葉片SSS活性均最高,遼糯12號次之,抽穗期遼粘3號高粱葉片SSS活性分別是遼糯12號、遼雜53號、遼雜11號的1.67倍、1.95倍、2.14倍;成熟期遼粘3號高粱葉片SSS活性分別是遼糯12號、遼雜53號、遼雜11號的1.34倍、2.24倍、1.39倍。

2.3.2 不同時期不同品種高粱籽粒中SSS活性比較分析 由圖6可知,除遼雜53號外,其余3個高粱品種成熟期籽粒SSS活性均高于抽穗期,遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號成熟期高粱籽粒SSS活性分別是抽穗期的1.44倍、1.38倍、1.48倍、94%。抽穗期高粱籽粒SSS活性表現(xiàn)為遼雜53號>遼粘3號>遼雜11號>遼糯12號;成熟期遼粘3號高粱籽粒SSS活性顯著高于其他3個高粱品種(P<0.05),分別比遼糯12號、遼雜11號、遼雜53號提高了17.57%、23.59%、25.74%。

2.4 不同時期不同品種高粱ADPG-ppase活性比較分析

2.4.1 不同時期不同品種高粱葉片中ADPG-ppase活性比較分析 由圖7可知,在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期4個時期內(nèi),不同高粱品種的變化趨勢不太一致,除遼雜11號外,其他高粱品種在抽穗期出現(xiàn)峰值,遼粘3號高粱葉片ADPG-ppase活性從苗期到抽穗期的變化比較大,抽穗期ADPG-ppase的活性是苗期的1.47倍。

苗期,高粱葉片ADPG-ppase活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號,遼粘3號顯著高于其他3個品種(P<0.05);拔節(jié)期,高粱葉片ADPG-ppase活性表現(xiàn)為遼糯12號>遼粘3號>遼雜53號>遼雜11號;抽穗期,遼粘3號高粱葉片ADPG-ppase活性顯著高于其他3個高粱品種,分別比遼糯12號、遼雜53號、遼雜11號提高了41.32%、43.91%、67.69%;成熟期遼糯12號高粱籽粒ADPG-ppase活性最高,遼粘3號次之。

2.4.2 不同時期不同品種高粱籽粒中ADPG-ppase活性比較分析 由圖8可知,4個高粱品種成熟期高粱籽粒ADPG-ppase活性均低于抽穗期,遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號成熟期高粱籽粒ADPG-ppase活性分別是抽穗期的78%、98%、84%、93%。抽穗期、成熟期高粱品種籽粒ADPG-ppase活性均表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號,抽穗期,遼粘3號高粱籽粒ADPG-ppase活性顯著高于其他3個品種,分別比遼糯12號、遼雜11號、遼雜53號提高了10.62%、30.72%、62.72%。

2.5 不同時期不同品種高粱UDPG-ppase活性比較分析

2.5.1 不同時期不同品種高粱葉片中UDPG-ppase活性比較分析 由圖9可知,在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期4個時期內(nèi),遼粘3號和遼糯12號葉片UDPG-ppase活性呈升高趨勢,遼雜11號和遼雜53號呈先升再降再升的變化趨勢,UDPG-ppase活性均在成熟期達到最高。遼粘3號成熟期高粱葉片UDPG-ppase活性是苗期的1.44倍。

苗期,高粱葉片UDPG-ppase活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜53號>遼雜11號,遼粘3號、遼糯12號、遼雜53號之間差異不顯著;拔節(jié)期高粱葉片UDPG-ppase活性表現(xiàn)為遼糯12號>遼雜11號>遼粘3號>遼雜53號;抽穗期和成熟期高粱葉片UDPG-ppase活性均表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號,4個高粱品種之間差異顯著,抽穗期遼粘3號高粱葉片UDPG-ppase活性分別比遼糯12號、遼雜11號、遼雜53號提高了11.37%、27.10%、29.65%;成熟期遼粘3號高粱葉片UDPG-ppase活性分別比遼糯12號、遼雜11號、遼雜53號提高了21.87%、26.83%、40.66%。

2.5.2 不同時期不同品種高粱籽粒中UDPG-ppase活性比較分析 由圖10可知,遼粘3號和遼糯12號成熟期高粱籽粒UDPG-ppase活性比抽穗期高,遼雜11號和遼雜53號成熟期高粱籽粒UDPG-ppase活性比抽穗期低。遼粘3號、遼雜11號、遼糯12號、遼雜53號成熟期高粱籽粒UDPG-ppase活性分別是抽穗期的1.33倍、87%、1.18倍、97%。抽穗期,高粱籽粒UDPG-ppase活性表現(xiàn)為遼雜11號>遼粘3號>遼糯12號>遼雜53號,其中遼雜11號與遼粘3號差異不顯著;成熟期,高粱籽粒UDPG-ppase活性表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號,遼粘3號高粱籽粒UDPG-ppase活性顯著高于其他品種,分別比遼糯12號、遼雜11號、遼雜53號提高了19.85%、51.21%、62.14%。

2.6 不同時期不同品種高粱SPS基因表達比較分析

2.6.1 不同時期不同品種高粱葉片中SPS基因表達比較分析 對4個高粱品種葉片的SPS基因表達量進行測定,選取遼粘3號高粱品種作為對照,發(fā)現(xiàn)苗期4個高粱品種葉片SPS基因表達量表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜53號>遼雜11號,遼粘3號高粱葉片SPS基因表達量顯著高于其他品種,分別是遼糯12號、遼雜53號、遼雜11號的2.11倍、4.90倍、7.41倍;拔節(jié)期,遼糯12號高粱葉片SPS基因表達量最高,遼粘3號次之;抽穗期遼粘3號、遼糯12號高粱葉片SPS基因表達量要顯著高于遼雜53號、遼雜11號;成熟期,4個高粱品種葉片SPS基因表達量表現(xiàn)為遼粘3號>遼雜11號>遼糯12號>遼雜53號,4個高粱品種之間差異均不顯著(圖11)。

2.6.2 不同時期不同品種高粱籽粒中SPS基因表達比較分析 對4個高粱品種籽粒SPS基因表達量進行測定,選取遼粘3號高粱品種作為對照,發(fā)現(xiàn)抽穗期和成熟期4個高粱品種籽粒SPS基因表達量均表現(xiàn)為遼糯12號>遼粘3號>遼雜53號>遼雜11號,抽穗期4個品種之間差異比較顯著,遼糯12號高粱籽粒SPS基因表達量分別是遼粘3號、遼雜53號、遼雜11號的1.83倍、2.22倍、2.78倍(圖12)。

3 討論與結論

3.1 不同高粱品種碳代謝關鍵酶活性的比較

蔗糖代謝和淀粉代謝是2種重要的糖代謝途徑,代謝途徑不同,所需要的關鍵酶也會有所差異。與蔗糖代謝相關的酶主要包括SS、SPS等[19];與淀粉代謝相關的酶主要包括SSS、ADPG-ppas、UDPG-ppase 等。其中UDPG-ppase可以催化三磷酸尿苷(UTP)和葡萄糖-1-磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG),UDPG和6-磷酸果糖在SPS催化下生成二磷酸尿苷(UDP)和6-磷酸蔗糖,6-磷酸蔗糖可以在磷酸酯酶脫磷酸作用下生成蔗糖[20];UDPG和果糖在SS催化作用下也可以生成蔗糖和UDP。葡萄糖-1-磷酸和三磷酸腺苷(ATP)在ADPG-ppas作用下可以生成淀粉合成的前體物質(zhì)ADPG,ADPG經(jīng)過SSS催化作用可以合成直鏈淀粉[21]。以上多種碳代謝相關酶相互合作協(xié)調(diào),共同調(diào)節(jié)蔗糖代謝和淀粉代謝過程。?？∑娴葘Ω收嵫芯堪l(fā)現(xiàn),SS、SPS活性的提高有利于蔗糖的積累[22]。王芳等研究發(fā)現(xiàn),ADPG-ppase、UDPG-ppase的活性與小麥籽粒中淀粉的積累速率呈正相關關系[23]。

本研究發(fā)現(xiàn),整個時期4個品種高粱葉片SS、SPS活性均呈先降后升的變化趨勢,拔節(jié)期活性最低,成熟期最高,這與李春陽等的研究結果[8]一致;4個高粱品種葉片的SSS、ADPG-ppase、UDPG-ppase活性隨生長時期的推進變化趨勢不大相同,但是SSS、UDPG-ppase活性均在成熟期最高,除遼雜11號外,其他高粱品種ADPG-ppase活性均在抽穗期達到峰值。抽穗期到成熟期是高粱籽粒逐漸生成并積累有機物的過程,葉片經(jīng)過光合作用等過程將產(chǎn)生的糖類等物質(zhì)源源不斷地運往籽粒,以供籽粒生長發(fā)育,所以抽穗期和成熟期對碳代謝產(chǎn)物需求更大,相關酶活性更高。

對同一時期不同高粱品種碳代謝相關酶活性比較發(fā)現(xiàn),抽穗期和成熟期遼粘3號高粱葉片和籽粒的SS活性均高于其他3個高粱品種,苗期和拔節(jié)期遼糯12號高粱葉片SS活性最高,遼粘3號次之;拔節(jié)期、抽穗期、成熟期遼粘3號高粱葉片和成熟期籽粒的SPS活性顯著高于其他品種;遼粘3號高粱葉片在苗期、抽穗期、成熟期的SSS活性均顯著高于其他3種高粱品種,成熟期籽粒SSS活性也是最高;苗期和抽穗期遼粘3號高粱葉片ADPG-ppase活性顯著高于遼雜11號、遼雜53號、遼糯12號,抽穗期、成熟期高粱籽粒的ADPG-ppase活性均表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號;抽穗期高粱葉片、成熟期高粱葉片和籽粒的UDPG-ppase活性均表現(xiàn)為遼粘3號>遼糯12號>遼雜11號>遼雜53號。整體上來說,遼粘3號高粱品種葉片和籽粒在各個時期的碳代謝相關酶活性都處于較高水平,有利于蔗糖、淀粉等物質(zhì)的積累,從而提高高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)。

3.2 不同高粱品種SPS基因表達的比較

SPS基因是作物蔗糖合成中重要的調(diào)節(jié)基因[24-25]。劉洋等采用同源克隆的方法,首次克隆了SPS3-1,可為高粱糖代謝分子機制的研究奠定基礎[26]。SPS基因在組織器官表達、蔗糖代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中具有重要意義[24]。楊明等檢測了高粱中SPS蛋白的表達,認為蔗糖積累與SPS的表達密切相關[27]。呂佳紅等研究發(fā)現(xiàn),翠冠果實中3個SPS基因變化趨勢與蔗糖積累一致,表明SPS基因與蔗糖積累關系非常密切[28]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn),苗期、抽穗期、成熟期遼粘3號高粱葉片SPS基因相對表達量最高,遼粘3號拔節(jié)期葉片和抽穗期、成熟期籽粒SPS基因相對表達量僅次于遼糯12號。同時,遼粘3號在抽穗期、成熟期葉片的SPS活性均顯著高于其他高粱品種,在抽穗期籽粒中的SPS活性僅低于遼糯12號,這與基因表達結果大體一致。

綜上所述,遼粘3號高粱品種葉片和籽粒在各個時期的SS、SPS、SSS、ADPG-ppase、UDPG-ppase均具有較高的活性;苗期、抽穗期、成熟期遼粘3號高粱葉片SPS基因相對表達量均為最高,抽穗期、成熟期遼粘3號高粱籽粒SPS基因相對表達量僅略低于遼糯12號,并且遼粘3號SPS基因相對表達量與SPS活性測定結果大體一致。因此,遼粘3號高粱品種可作為高粱生產(chǎn)中的首選品種,為篩選高產(chǎn)高效的高粱品種提供了重要依據(jù)。