李鎮(zhèn)宏，李昊卿，李嘉欣，曾憲垠，韓興發(fā)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014）

骨骼肌生長(zhǎng)沉積是影響家畜生產(chǎn)性能及飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)效益的主要因素之一[1-2]。骨骼肌細(xì)胞分化、生長(zhǎng)及肌肉沉積受多種內(nèi)分泌激素調(diào)控。公畜中，睪酮和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）是促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)沉積的主要激素，而糖皮質(zhì)激素則是引起骨骼肌降解萎縮的主要激素[3]。3 種激素間的動(dòng)態(tài)拮抗平衡是決定公畜骨骼肌沉積量的重要機(jī)制[3]。

在畜牧生產(chǎn)中，手術(shù)去勢(shì)又稱外科閹割是一種古老且廣泛采用的生產(chǎn)管理技術(shù)，常用于降低公畜間的爬跨、打斗行為，以及改善畜禽肉品質(zhì)[4-5]。近年來隨著社會(huì)對(duì)動(dòng)物福利的日趨重視，手術(shù)去勢(shì)越來越不被人們所接受[6]。目前，促性腺激素釋放激素（GnRH）主動(dòng)免疫又稱免疫去勢(shì)，已成為替代傳統(tǒng)手術(shù)去勢(shì)的動(dòng)物友好的新去勢(shì)方法[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)引起的動(dòng)物性激素缺乏[9]或是衰老引起人的性激素分泌降低[10]均導(dǎo)致骨骼肌萎縮。手術(shù)去勢(shì)與免疫去勢(shì)均顯著降低動(dòng)物性激素含量[8,11-12]，但免疫去勢(shì)公畜骨骼肌肉含量通常顯著高于手術(shù)去勢(shì)公畜[7-8]。手術(shù)去勢(shì)與免疫去勢(shì)如何差異影響動(dòng)物骨骼肌沉，目前鮮見報(bào)道。據(jù)此，本研究以SD雄鼠為模型，對(duì)比研究免疫去勢(shì)和手術(shù)去勢(shì)對(duì)骨骼肌組織學(xué)、骨骼肌沉積調(diào)控相關(guān)激素含量及相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響，以解析兩種不同去勢(shì)技術(shù)對(duì)公畜骨骼肌沉積的差異影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 GnRH疫苗制備

參照我們前期所描述的方法[13]制備GnRH 疫苗。即通過化學(xué)合成法合成GnRH 十肽的串聯(lián)體，為方便與載體蛋白偶聯(lián)，合成過程中將GnRH 分子中第6 位甘氨酸（Gly）替換為D 型賴氨酸（D-Lys）。多肽合成后與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，偶聯(lián)物經(jīng)高效液相色譜純化后與Specol 佐劑乳化，即為GnRH疫苗。

1.2 動(dòng)物分組及處理

將36 只6 周齡體重相近的SD 雄鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（entire males, EM）、手術(shù)去勢(shì)組（orchectomy, ORC）和GnRH免疫組（immunocastration, IM），每組12 只。其中，對(duì)照組不做任何處理，手術(shù)去勢(shì)組雄鼠在6周齡時(shí)進(jìn)行手術(shù)去勢(shì)。免疫去勢(shì)組雄鼠在8周齡時(shí)于前腿部肌肉注射0.5 mL 100 μg GnRH肽當(dāng)量去勢(shì)疫苗，4 周后以同樣的免疫方式和劑量進(jìn)行加免，對(duì)照組和手術(shù)去勢(shì)組雄鼠注射不含GnRH抗原的疫苗乳化劑。試驗(yàn)期間所有雄鼠自由采食和飲水，加免后8周（即20周齡）將所有動(dòng)物麻醉處死后取樣。

1.3 樣品采集

20 周齡時(shí)，雄鼠過夜饑餓8 h 后稱重并在麻醉處死前通過摘眼球法采血。所有血樣于4 ℃，2 000 g 離心15 min 后分離血清，血清保存于-20 ℃冰箱，用以測(cè)定血清激素及尿素氮含量。雄鼠處死后，迅速分離下肢腓腸肌、睪丸、附睪及腎上腺并稱重，計(jì)算腓腸肌/體重的比值。部分腓腸肌和睪丸浸泡于4%的多聚甲醛，用于組織學(xué)分析，其余組織液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 血清激素及尿素氮含量測(cè)定

利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）技術(shù)測(cè)定雄鼠血清中睪酮（T）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）和皮質(zhì)酮（CORT）濃度。測(cè)定方法嚴(yán)格參照試劑盒（Cusabio Biotech Co. Ltd）的操作說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。睪酮、IGF1及皮質(zhì)酮測(cè)定靈敏度分別為0.06 ng/mL，0.151 ng/mL 及0.1 ng/mL。所測(cè)定激素批內(nèi)及批間變異系數(shù)均＜12%。

雄鼠血清尿素氮含量的測(cè)定參照我們以前所描述的方法[11]進(jìn)行。

1.5 腓腸肌及睪丸組織學(xué)分析

將經(jīng)4%多聚甲醛固定的腓腸肌和睪丸通過石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（H&E）染色后，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察組織學(xué)變化。采用Image J (v. 1.8)顯微圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)樣品中100根肌纖維的截面積，算術(shù)平均后得到肌纖維的平均截面積。

1.6 基因檢測(cè)

用液氮將腓腸肌和腎上腺組織研磨至粉狀，取約100 mg 組織粉末通過苯酚-氯仿法提取組織總RNA。參照試劑盒（Invitrogen Co. Carlsbad, CA,USA）說明書進(jìn)行RNA提取。凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，然后用Nanodrop 2000 測(cè)定總RNA 濃度及純度。取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑采用試劑 盒PrimeScript?RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa, Dalian, China）。以cDNA 為模板，設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1），利用熒光定量PCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s, 59～61 ℃退火，延伸25 s，反應(yīng)結(jié)束后用熔解檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因，目的基因mRNA 表達(dá)經(jīng)內(nèi)參基因正后，采用2-△△ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Graphpad Prism 9.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用AVOVA單因素方差分析對(duì)指標(biāo)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄鼠GnRH免疫去勢(shì)效果

如圖1所示，與對(duì)照雄鼠（EM）相比，雄鼠GnRH主動(dòng)免疫后睪丸（圖1A）、附睪（圖1B）重量及血清睪酮濃度（圖1C）顯著降低（P＜0.001）。睪丸組織切片顯示，對(duì)照雄鼠睪丸結(jié)構(gòu)完整，曲精細(xì)管包括各級(jí)生精細(xì)胞和成熟精子（圖1D方框所示），而GnRH免疫雄鼠睪丸曲精細(xì)管管腔空蕩，精子發(fā)生完全被阻斷，管腔中無精子細(xì)胞和成熟精子，表明GnRH主動(dòng)免疫達(dá)到了良好的免疫去勢(shì)效果。

圖1 GnRH主動(dòng)免疫對(duì)雄鼠睪丸、附睪重量、血清睪酮濃度及睪丸組織學(xué)的影響Figure 1 Effects of active immunization against GnRH on testes and epididymides weight, serum testosterone levels and testes morphology in male rats

2.2 GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠骨骼肌萎縮的影響

如圖2 所示，與對(duì)照組（EM）相比，雄鼠手術(shù)去勢(shì)與GnRH 主動(dòng)免疫后腓腸肌重量均降低（圖2A；P＜0.01），但GnRH免疫組雄鼠腓腸肌重量仍高于手術(shù)去勢(shì)組雄鼠（P=0.09）。當(dāng)使用體重矯正腓腸肌重量后（即腓腸肌指數(shù)）發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比雄鼠手術(shù)去勢(shì)后腓腸肌指數(shù)降低（圖2B；P＜0.01），而GnRH主動(dòng)免疫后雄鼠腓腸肌指數(shù)僅顯示出下降的趨勢(shì)（圖2B；P=0.09），但腓腸肌指數(shù)在手術(shù)去勢(shì)組雄鼠與GnRH免疫組雄鼠間無顯著差異（P＞0.05）。切片分析顯示，雖手術(shù)去勢(shì)和免疫去勢(shì)對(duì)雄鼠腓腸肌肌纖維面積無顯著影響（圖2C 和D；P＞0.05），但兩種去勢(shì)處理后雄鼠部分腓腸肌肌纖維均出現(xiàn)了降解萎縮的跡象（圖2D 箭頭所示），且手術(shù)去勢(shì)雄鼠腓腸肌降解萎縮肌纖維數(shù)量明顯多于GnRH免疫雄鼠（圖2D）。

圖2 GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠腓腸肌重量、指數(shù)及組織學(xué)的影響Figure 2 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the mass, ratio and histology of gastrocnemius muscle in male rats

2.3 GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠肝臟重量及血清IGF1濃度的影響

如圖3 所示，與對(duì)照組（EM）相比，雄鼠GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)后肝臟重量及指數(shù)均降低（圖3A 和B；P＜0.05），且GnRH 免疫組雄鼠與手術(shù)去勢(shì)雄鼠間肝臟重量及指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。與對(duì)照組（EM）相比，手術(shù)去勢(shì)降低雄鼠血清IGF1濃度（圖3C；P＜0.001），而GnRH 免疫僅有降低雄鼠血清IGF1 濃度的趨勢(shì)（P=0.063）。雄鼠處死時(shí)，GnRH 免疫組大鼠血清IGF1 濃度仍顯著高于手術(shù)去勢(shì)組大鼠（P＜0.05）。

圖3 GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)大鼠肝臟重量、指數(shù)及血清IGF1濃度的影響Figure 3 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the liver mass and ratio, and serum IGF1 concentrations in male rats

2.4 GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠腎上腺重量及皮質(zhì)酮分泌的影響

如圖4所示，與對(duì)照組（EM）相比，GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠腎上腺重量及指數(shù)均無顯著影響（圖4A 和B，P＞0.05）。與對(duì)照組相比，手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠血清皮質(zhì)酮濃度無顯著影響（圖4C，P＞0.05），而GnRH主動(dòng)免疫卻顯著降低雄鼠血清皮質(zhì)酮濃度（P＜0.05）。qPCR 檢測(cè)腎上腺皮質(zhì)酮合成關(guān)鍵酶基因mRNA 表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GnRH 主動(dòng)免疫顯著下調(diào)腎上腺HSD3β1（圖4D，P＜0.05），而對(duì)腎上腺Star和Cyp11a1mRNA 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。而與對(duì)照組相比，手術(shù)去勢(shì)對(duì)大鼠腎上腺上述皮質(zhì)酮合成關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)均無顯著影響（圖4D，P＞0.05）。

圖4 GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)大鼠腎上腺重量、指數(shù)及皮質(zhì)酮合成的影響Figure 4 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the adrenal mass and ratio, as well as corticosterone biosynthesis in male rats

2.5 GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)雄鼠血清尿素氮及腓腸肌沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組（EM）相比，GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)均顯著增加血清尿素氮濃度（圖5A，P＜0.001），但GnRH 免疫組雄鼠血清尿素氮濃度顯著低于手術(shù)去勢(shì)組雄鼠（P＜0.001）。qPCR 分析顯示，與對(duì)照組（EM）相比，手術(shù)去勢(shì)下調(diào)腓腸肌Igf1rmRNA 表達(dá)水平（圖5B，P＜0.05），而上調(diào)MstnmRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），對(duì)Ar及Igf1mRNA 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。而，與對(duì)照組相比，GnRH主動(dòng)免疫對(duì)大鼠腓腸肌所檢測(cè)肌肉沉積相關(guān)基因mRNA表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05）。

圖5 GnRH主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)大鼠血清尿素氮及腓腸肌沉積調(diào)控相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Figure 5 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on serum urea nitrogen levels and mRNA expressions of gastrocnemius accumulation-associated key genes in male rats

3 討論

骨骼肌約占家畜胴體重的30%～60%，是產(chǎn)肉家畜飼養(yǎng)的主要生產(chǎn)目標(biāo)。骨骼肌沉積受多種因素影響，其中睪酮和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）是促進(jìn)公畜骨骼肌生長(zhǎng)沉積的主要調(diào)控激素[3,9]。去勢(shì)引起公畜血清睪酮及IGF1濃度顯著降低，顯著降低公畜胴體骨骼肌含量[8,14-15]。與前人研究結(jié)果一致，本研究中雄鼠手術(shù)去勢(shì)后血清睪酮和IGF1 濃度均顯著降低，腓腸肌質(zhì)量和指數(shù)均顯著降低，表明去勢(shì)顯著降低了雄鼠骨骼肌沉積量。與手術(shù)去勢(shì)一致，GnRH主動(dòng)免疫也降低雄鼠血清睪酮和IGF1濃度，但GnRH免疫雄鼠血清IGF1濃度仍顯著高于手術(shù)去勢(shì)雄鼠。我們前期在豬及大鼠上也得到類似的結(jié)果[11-12]。因此，雄鼠GnRH 主動(dòng)免疫后腓腸肌質(zhì)量仍高于手術(shù)去勢(shì)雄鼠，這可能與其體內(nèi)相對(duì)較高的IGF1濃度有關(guān)。

畜體骨骼肌含量多少是其合成與分解動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果[16]。腎上腺分泌的糖皮質(zhì)激素是促進(jìn)機(jī)體肌肉蛋白分解，致使骨骼肌萎縮減少的重要調(diào)控激素[3,17]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)去勢(shì)和GnRH主動(dòng)免疫對(duì)雄鼠腎上腺重量和指數(shù)均無顯著影響，但GnRH 主動(dòng)免疫選擇性降低了雄鼠血清皮脂酮濃度。前人研究結(jié)果也顯示，去勢(shì)對(duì)公畜例如公豬血清糖皮質(zhì)激素濃度無顯著影響[18]。qPCR分析顯示，GnRH主動(dòng)免疫主要通過下調(diào)腎上腺皮質(zhì)酮合成關(guān)鍵基因HSD3β1的表達(dá)，進(jìn)而降低皮質(zhì)酮合成。GnRH 主動(dòng)免疫如何選擇性降低腎上腺HSD3β1mRNA表達(dá)，進(jìn)而降低血清糖皮質(zhì)激素濃度，目前不清楚，有待深入研究。血清糖皮質(zhì)激素濃度降低意味著由其驅(qū)動(dòng)的肌肉蛋白分解減緩。因此，雄鼠GnRH主動(dòng)免疫后其骨骼分解萎縮程度較手術(shù)去勢(shì)后低，這還可能與其體內(nèi)相對(duì)較低的皮脂酮濃度有關(guān)。

血清尿素氮水平是反映動(dòng)物機(jī)體蛋白分解流失的重要指示指標(biāo)[19-20]。本研究中，雄鼠GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)后血清尿素氮濃度均顯著升高，這與兩種去勢(shì)處理后雄鼠骨骼肌沉積量相較于對(duì)照雄鼠均降低的結(jié)果一致，表明雄激素濃度降低或缺乏所引起的肌肉蛋白分解是兩種去勢(shì)處理導(dǎo)致雄性動(dòng)物骨骼肌沉積量減少的共同原因。但值得注意的是，雄鼠GnRH 主動(dòng)免疫后血清尿素氮濃度仍顯著低于手術(shù)去勢(shì)雄鼠，表明免疫去勢(shì)雄鼠骨骼肌分解程度或速度較低是其骨骼肌沉積量較手術(shù)去勢(shì)雄鼠多的重要原因。同時(shí)，qPCR 分析也證實(shí)手術(shù)去勢(shì)雄鼠腓腸肌肌肉分解關(guān)鍵基因Mstn表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和GnRH免疫組雄鼠。

對(duì)比研究?jī)煞N不同去勢(shì)處理對(duì)雄鼠腓腸肌沉積關(guān)鍵調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)手術(shù)去勢(shì)除選擇性上調(diào)腓腸肌Mstn表達(dá)外，還選擇性下調(diào)腓腸肌胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（Igf1r）基因表達(dá)。這表明Igf1r表達(dá)的下調(diào)也可能是介導(dǎo)手術(shù)去勢(shì)降低動(dòng)物機(jī)體骨骼肌含量的重要原因。除上述兩個(gè)基因外，兩種去勢(shì)處理均不影響腓腸肌雄激素受體（Ar）及Igf1基因表達(dá)。除肝臟分泌的IGF1外，肌肉組織自身產(chǎn)生IGF1 通過自分泌和旁分泌途徑在促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)沉積調(diào)控中也發(fā)揮重要作用[3]。因此，兩種去勢(shì)處理可能均不會(huì)通過影響骨骼肌自身IGF1的合成來調(diào)控自身的生長(zhǎng)萎縮。同時(shí)，兩種去勢(shì)處理降低血液睪酮含量后，也不會(huì)通過影響骨骼肌Ar的表達(dá)來進(jìn)一步加劇骨骼肌萎縮。

4 結(jié)論

綜上所述，相較于GnRH主動(dòng)免疫（免疫去勢(shì)），手術(shù)去勢(shì)引起雄鼠更為顯著的骨骼肌分解萎縮，這與其體內(nèi)相對(duì)較低的IGF1 和相對(duì)較高的糖皮質(zhì)激素含量有關(guān)。因此，GnRH 主動(dòng)免疫相較于手術(shù)去勢(shì)更適合用于家畜的去勢(shì)管理和更有利于公畜的骨骼肌沉積。